咯利普兰治疗大鼠脊髓横断损伤的实验研究①

李锋涛，程斌，李浩鹏，臧全金，张廷，贺西京

·基础研究·

咯利普兰治疗大鼠脊髓横断损伤的实验研究①

李锋涛1a，程斌1b，李浩鹏1a，臧全金1a，张廷1a，贺西京1a

目的 探索咯利普兰治疗大鼠脊髓横断损伤的可行性。方法取健康成年雌性Sprague-Dawley大鼠30只，随机分为假手术组(Sham组)、损伤组(SCI组)、咯利普兰治疗组(R组)，每组10只。R组建立大鼠脊髓横断损伤模型后立刻皮下注射咯利普兰；Sham组仅打开椎板；SCI组及Sham组皮下注射相同体积二甲基亚砜(DMSO)。于损伤后2、4、6、8周采用BBB评分法观察大鼠后肢运动功能情况，损伤后2周时应用免疫组织化学染色检测各组生长相关蛋白-43(GAP-43)及胶质细胞酸性蛋白(GFAP)的表达。结果损伤后6周、8周时，R组BBB评分优于SCI组(P＜0.05)。损伤后2周，R组GAP-43表达高于SCI组(P＜0.05)，GFAP表达量低于SCI组(P＜0.05)。结论咯利普兰能提高大鼠脊髓横断损伤神经功能评分，提高GAP-43表达，抑制GFAP表达。

脊髓损伤；咯利普兰；运动功能；生长相关蛋白43；胶质细胞酸性蛋白；大鼠

[本文著录格式]李锋涛，程斌，李浩鹏，等.咯利普兰治疗大鼠脊髓横断损伤的实验研究[J].中国康复理论与实践,2013,19 (7):628-630.

研究发现，提高神经元胞体内环磷酸腺苷(cAMP)的含量，可促进脊髓背根神经节损伤后新生轴突在抑制性环境中的生长[1]。咯利普兰(rolipram)是第一代磷酸二酯酶Ⅳ(PDEⅣ)特异性抑制剂，可通过特异性抑制PDEⅣ对细胞内cAMP的水解作用，提高细胞内cAMP含量，发挥多种生理作用，如抗炎、免疫调节、抑制凋亡等。本实验观察咯利普兰对大鼠脊髓横断损伤的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

生长相关蛋白-43(growth associated protein 43, GAP-43)及胶质细胞酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司；咯利普兰：美国SIGMA公司；图像信号采集与分析系统：德国LEICA公司。

1.2 动物分组及造模

成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠30只，体重(225±23)g，购买于西安交通大学医学院动物实验中心，清洁级。将实验动物随机分为假手术组(Sham组，n=10)、损伤对照组(SCI组，n=10)、咯利普兰治疗组(R组，n=10)。

所有动物术前禁食过夜，自由饮水。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉。将动物固定在手术台上，常规消毒，以T9为中心取背侧正中切口，切除T9、T10全椎板，暴露脊髓组织。找出T9、T10椎间盘，从脊髓一侧用小圆针0号丝线穿过T9、T10椎间盘组织，并从另一侧出来，于丝线头侧1 mm(T9水平)处横向切断脊髓组织及部分椎间盘，无阻力提出预置线，确保脊髓组织完全横断。7-0无损伤线缝合损伤区两侧的硬脊膜，棉签压迫止血，生理盐水冲洗伤口；依次缝合伤口。Sham组仅打开椎板暴露脊髓，不损伤脊髓。术后每日人工膀胱按摩2次，直至膀胱排尿反射恢复。术后3只大鼠因泌尿系感染死亡，其中R组1只，SCI组2只，均按相同条件予以补充。

1.3 治疗方法

将咯利普兰溶于二甲基亚砜(DMSO)中。R组于建模后立即皮下注射0.5 mg/kg·d，分4次注射，共10 d。其余各组按相同方法于皮下注射同体积DMSO。

1.4 检测指标

1.4.1 大鼠后肢运动功能评分 采用双人双盲取平均值的方法，按照BBB评分法分别于损伤后2、4、6、8周对各组动物的后肢运动功能进行评分。

1.4.2 免疫组织化学染色 损伤后2周时处死动物(每组5只)，4%多聚甲醛灌注，取出T9节段脊髓，石蜡包埋，于损伤头尾侧2 mm范围内连续切片，厚10 μm。按照试剂盒操作步骤分别进行GAP-43及GFAP免疫组织化学染色。应用LEICA Q500IW图像信号采集与分析系统进行图像采集处理。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 后肢运动功能评分

损伤后2周时，除Sham组外，其他各组动物后肢BBB评分为0分；4周时，后肢运动功能有轻微恢复，R组与SCI组之间无显著性差异(t=1.13,P＞0.05)；6周、8周时，R组与SCI组间有显著性差异(t=2.34,P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠后肢神经BBB评分比较

2.2 免疫组织化学染色

2.2.1 GAP-43 Sham组有少量GAP-43蛋白表达于神经元胞浆中。各损伤组动物脊髓组织中GAP-43蛋白表达较Sham组明显增加，以R组表达量最多。见图1、表2。

2.2.2 GFAP Sham组有少量GFAP阳性胶质细胞散在分布于灰质和白质中。SCI组GFAP阳性胶质细胞大量增生，排列不整，形成明显的瘢痕组织。R组较SCI组GFAP阳性胶质细胞着色较浅，数量较少。见图2、表2。

表2 各组GFAP及GAP-43表达比较(平均灰度值)

图1 各组治疗后2周GAP-43表达(免疫组织化学染色，400×)

图2 各组治疗后2周GFAP表达(免疫组织化学染色，400×)

3 讨论

SCI后轴突再生失败的原因主要有两个：损伤后中枢神经系统内的抑制性因素，如NogoA、髓鞘相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMgp)等的抑制作用，以及有限的轴突再生能力(局部神经细胞的大量坏死和凋亡、神经营养因子的缺乏等)。虽然损伤区残存的轴突可发芽生长较短距离[2]，但这些再生的轴突生长锥由于缺乏神经营养因子的支持，以及受到髓鞘抑制性分子、胶质瘢痕的化学性和物理性抑制等，很快发生萎缩[3-4]，不能形成较长距离的新生轴突穿出损伤区与靶细胞发生突触连接，使再生失败。

研究发现，提高神经元胞体内cAMP的含量，可促进脊髓背根神经节损伤后新生轴突在抑制性环境中的生长[1]。细胞内cAMP含量的升高，激活蛋白激酶A(PKA)和丝裂原激活蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路，使转录因子cAMP效应元件结合蛋白(CREB)发生磷酸化而被活化。活化的CREB可引起相关基因的转录，促使新生轴突抵抗MAG和髓鞘的抑制而再生。

咯利普兰可通过抑制细胞内PDEⅣ，减少cAMP的水解，引起多种生物学功能：①减少前炎性因子白细胞介素(IL)-13、IL-5、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素(IFN-γ)的表达，减轻炎症反应；②降低血脑屏障的通透性，减少炎性细胞及有害因子穿过血脑屏障引起的组织损伤；③降低诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，减少一氧化氮(NO)等超氧化合物的生成[5]；④激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，抑制促凋亡蛋白Bad和caspase-3的活化，同时使Bcl-2磷酸化而被激活，从而减少细胞凋亡；⑤促进中枢神经损伤后新生轴突克服抑制性分子如Nogo、MAG和OMgp的抑制而生长。此外，咯利普兰还可阻止Ca2+内流，减少Ca2+介导的死亡通路，抑制损伤区轴突脱髓鞘作用。Antonio等应用咯利普兰治疗大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，可明显抑制EAE动物脊髓和淋巴结内基质金属蛋白酶(MMP-9)基因的转录，降低核因子(NF-κB)的表达水平，抑制炎性细胞因子的合成[6]。Folcik等发现，咯利普兰可降低大鼠中枢神经系统血管内皮通透性，阻止炎性细胞的侵润，减轻组织水肿[7]。Nikulina等发现，咯利普兰在体外可克服MAG或者髓鞘对神经元的抑制作用，促进轴突的生长[8]。

本研究显示，咯利普兰能改善大鼠脊髓横断损伤后的神经运动功能，提高GAP-43的表达，抑制GFAP的合成，提示抑制星形胶质细胞的增生，为神经轴突生长提供一定的条件。

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Effects of Rolipram on Spinal Cord Transection Injury in Rats

LI Feng-tаo,CHENG Bin,LI Hаo-peng,et аl.Depаrtment of Orthopedics,the Second Hospitаl of Xi'аn Jiаotong University,Xi'аn 710004,Shааnxi,Chinа

ObjectiveTo investigate the possibility of rolipram for treatment of spinal cord injury(SCI)in rats.Methods30 adult female Sprague-Dawley rats were divided into sham-operation group(sham group,n=10),spinal cord injury group(SCI group,n=10)and rolipram treatment group(R group,n=10).The rats in SCI group and R group were modeled as spinal cord transection injury,and R group was administrated with rolipram subcutaneouly after SCI.They were assessed with Basso Beattie and Bresnahan(BBB)score 2,4,6,and 8 weeks after SCI,and the expressions of growth associated protein 43(GAP-43)and glial fibrillary acidic protein(GFAP)were detected with immunohistochemistry 2 weeks after SCI.ResultsThere were significant difference in the BBB scores between SCI and R groups 6 and 8 weeks after SCI(P＜0.05).The expression of GAP-43 was more and GFAP was less in R group than in SCI group(P＜0.05).ConclusionRolipram can increase the expression of GAP-43 and inhibit the expression of GFAP,while improves the the motor function in rats after spinal cord transsection injury.

spinal cord injury;rolipram;motor function;growth associated protein 43;glial fibrillary acidic protein;rats

R681.2

A

1006-9771(2013)07-0628-03

2012-07-19

2012-11-28)

1.西安交通大学第二附属医院，a.骨二科；b.骨三科，陕西西安市710004。作者简介：李锋涛(1980-)，男，陕西兴平市人，博士，主治医师，主要研究方向：脊柱外科。通讯作者：贺西京，教授，博士生导师，主要研究方向：脊柱外科。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.07.009