小分子PIM 激酶抑制剂的研究进展

郑小洲，金晓磊，赵临襄

(沈阳药科大学 基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室，辽宁 沈阳110016)

1 PIM 激酶的结构

PIM-1 基因最早作为莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒整合位点(proviral integration site of moloney murine leukemia virus)而得名。PIM 激酶家族有3 名成员:PIM-1、PIM-2 和PIM-3 激酶，同属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它们的氨基酸序列具有同源性:PIM-1 和PIM-2 为61%，PIM-1 和PIM-3 为71%［1－2］。目前，PIM-1 和PIM-2 激酶研究得较多，而关于PIM-3 的晶体结构未见报道。

Figure 1 Inhibitor interactions in the ATP pocket［4］

PIM-1 激酶有34 kDa 和44 kDa 两种，其中以44 kDa 的激酶为主。PIM-1 是典型的双叶型激酶结构，N 端主要是反向平行的β 折叠，C 端主要是α 螺旋，N 端和C 端两个结构域通过短的铰链区连接。这两个结构域之间接口处的口袋构成了活性部位(图1)，包含铰链区(残基122-127)、N 末端结构域中富含甘氨酸的环(残基44-52)和C 末端结构域中的活化环(残基186-210)［3－4］。PIM-2 激酶有34 kDa、38 kDa 和40 kDa 三种，其中以34 kDa 的激酶为主。PIM-2 也是典型的双叶型蛋白质结构，具有与PIM-1 相似的活性口袋。

2 PIM 激酶与肿瘤

PIM 激酶通过多种机制影响肿瘤细胞的存活和增殖:PIM-1 和转录因子c-myc 对前列腺癌和淋巴瘤的形成具有协同作用，PIM-1 在c-myc 基因诱导的小鼠前列腺癌中高表达［5］;PIM-1 磷酸化BAD 蛋白Ser112 位点(BAD 蛋白失活的门控位点)，使BAD 蛋白失去促凋亡活性;PIM 激酶可以调节细胞周期，诱导细胞的增殖，例如:PIM-1 磷酸化细胞周期磷酸酯酶CDC25A 并增强其活性，促进细胞G1/S 期的进程;PIM-1 激酶介导细胞周期抑制剂p27Kip1和p21cip1/WAP1的磷酸化作用，抑制PCNA(增殖细胞核抗原)与p21cip1/WAP1结合，促进细胞G1 期和G2/M 期的进程［6－7］;PIM 激酶既可以正向调节STAT3 和Wnt 信号传导通路，也可正向调节NFκB 信号传导系统，从而促进细胞增殖。

3 小分子PIM 激酶抑制剂

3.1 咪唑并［1，2-b］哒嗪类和三唑并［4，3-b］哒嗪类化合物

Chen 等［8］发现咪唑并［1，2-b］哒嗪类化合物(图2)有很好的可改造性和成药性。其中最具代表性的是K00135 和SGI-1776。在小鼠Ba/F3 细胞激酶试验中，K00135 对PIM-1 和PIM-2 有良好的抑 制 作 用，IC50分 别 为0.12 μmol·L－1和1.8 μmol·L－1［9］。化合物SGI-1776 对B 细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)具有凋亡诱导作用(PIM-1，IC50= 7 nmol·L－1;PIM-2，IC50=363 nmol·L－1;PIM-3，IC50= 69 nmol·L－1)。2008 年11 月，FDA 批准SuperGen 公司开始SGI-1776 的Ⅰ期临床试验，由于试验中出现了心脏QTc 间期延长的现象，2010 年11 月该化合物的临床试验被迫终止。之后Blanco-Aparicio 等［10］发现ETP-39010 是一种有效的PIM 激酶抑制剂(PIM-1，IC50= 130 nmol·L－1;PIM-2，IC50=420 nmol·L－1;PIM-3，IC50=79 nmol·L－1)。

Grey 等［11］通过对咪唑并哒嗪母核的改造，得到了三唑并［4，3-b］哒嗪类化合物，例如化合物1 和2(图3)。将化合物1 的环己基对位引入羟基(化合物2)可以明显改善物理性质:clogP=2.8，clogD7.4=3.9，溶解度为170 μmol·L－1，MDCK 渗透性为35.3/49.0。多种激酶活性测试发现，化合物2 对PIM-1 具有良好的抑制活性和高度选择性(PIM-1，Ki＜5 nmol·L－1)。

Figure 2 Imidazo［1，2-b］pyridazines as PIM kinase inhibitors

Figure 3 1，2，4-triazolo［4，3-b］pyridazines as PIM kinase inhibitors

3.2 苯并［c］［2，6］萘啶类化合物

苯并［c］［2，6］萘啶类化合物CX-4945(图4)作为首个CK2 激酶的ATP 竞争性抑制剂已进入临床试验［12］。通过对238 种激酶进行抑制活性筛选，Siddiqui-Jain 等［13］发现该化合物还具有PIM-1激酶抑制活性(CK2，IC50= 0.001 μmol·L－1;PIM-1，IC50=0.046 μmol·L－1)。Pierre 等［14］对CX-4945 的结构进行修饰，设计并合成了一系列结构类似的化合物(图4)，由急性髓性白血病细胞株MV-4-11 的抗增殖实验可知，这类化合物均有较好的PIM 激酶抑制活性。例如化合物3(CK2，IC50＞0.5 μmol·L－1;PIM-1，IC50= 0.027 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.018 μmol·L－1)。构效关系表明:C-7位引入三氮唑(化合物3)使CK2 活性减弱，PIM-1活性增强，从而选择性抑制PIM-1 激酶;C-5 位的2'-氯苯胺或2'-氟苯胺使活性提高到纳摩尔级，如化合物4(PIM-1，IC50=0.005 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.003 μmol·L－1;PIM-3，IC50=0.057 μmol·L－1);将母核A 环换成五元环，如吡咯、噻吩、咪唑等［15］，既可保持对PIM 激酶的抑制活性，也恢复了对CK2 激酶的抑制活性。以化合物5 为例，对PIM-1、PIM-2 和CK2 的IC50值 分 别 为0.003、0.002、0.009 μmol·L－1。

Figure 4 Benzo［c］［2，6］naphthyridines as PIM kinase inhibitors

3.3 苯亚甲基联噻唑烷类化合物

经过高通量筛选，Beharry 和Xia 等［16－17］发现了苯亚甲基联噻唑烷类PIM 激酶抑制剂。对50多种蛋白激酶活性筛选后发现这类化合物对PIM激酶有高选择性。在此基础上，Dakin 等［18］设计并合成了一系列苯亚甲基联噻唑烷-2，4-二酮衍生物，例 如化合物6(PIM-1，IC50=0. 024 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.1 μmol·L－1)、化合物7(PIM-1，IC50=0.15 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.02 μmol·L－1)、化 合 物8 (PIM-1，IC50＜0.004 μmol·L－1，PIM-2，IC50= 0.05 μmol·L－1，PIM-3，IC50＜0.003 μmol·L－1)，上述化合物6 ～8 的结构见图5。

Figure 5 Benzylidene-linked thiazolidines as PIM kinase inhibitors

3.4 苯并［4，5］噻吩并［3，2-d］嘧啶酮类化合物

Tao 等［19］通过高通量筛选发现:苯并［4，5］噻吩并［3，2-d］嘧啶酮类化合物(图6)对K562和MV4-11 细胞具有有效的抗增殖活性，例如化合物9(PIM-1，Ki=63 nmol·L－1;PIM-2，Ki=160 nmol·L－1)。该类化合物构效关系如下:2 位引入二甲氨基甲基，化合物对PIM-1 和PIM-2 的活性增加，例如化合物10(PIM-1，Ki=14 nmol·L－1;PIM-2，Ki=63 nmol·L－1);2 位引入羟基吡咯烷基，化合物对PIM-1 和PIM-2 活性保持(与化合物10 相比)，如化合物11(PIM-1，Ki=5 nmol·L－1;PIM-2，Ki=29 nmol·L－1);8 位引入疏水性强的环丙乙烯基可大大增加化合物的PIM-1 和PIM-2 抑制活性，如化合物12(PIM-1，Ki=1 nmol·L－1;PIM-2，Ki=2 nmol·L－1);8 位引入苯基取代基可以明显增强PIM 激酶抑制活性，其中抑制活性大小为:对羟基苯基＞间羟基苯基＞邻甲基苯基，如化合物13(PIM-1，Ki= 2 nmol·L－1;PIM-2，Ki= 3 nmol·L－1，PIM-3，Ki=0.5 nmol·L－1)。

Figure 6 3H-Benzo［4，5］thieno［3，2-d］pyrimidin-4-ones as PIM kinase inhibitors

3.5 酰腙类化合物

Figure 7 Acylhydrazones as PIM kinase inhibitors

Chang 等［20］为了得到对W10 小鼠B-淋巴瘤细胞株有细胞毒性的化合物，通过高通量筛选发现了3 个结构类似的酰腙类化合物21A8、21H7和65D4(图7)，它们对W10 细胞的LD50值为0.4 ～1.0 μmol·L－1，而对正常细胞无显著影响，其中65D4 能最有效地抑制癌细胞存活。为了改善65D4 的水溶性，对其A、B、C 三个区域进行了结构改造(图7):包括将A 区域的苯环换成嘧啶环，并在间位引入吗啡啉基团;变化连接吗啡啉环碳链的长度;在C区域引入羟基和卤素。经过结构改造得到了21 种对前列腺癌细胞生长有抑制作用的化合物，其中M110 对DU-145 细胞抑制活性最好，IC50=0.9 μmol·L－1。激酶活性筛选实验结果表明:M110 是高选择的PIM 激酶抑制剂(PIM-1，IC50= 2.5 μmol·L－1;PIM-2，IC50=2.5 μmol·L－1，PIM-3，IC50= 0.05 μmol·L－1);M110 对上皮细胞瘤有效，可以抑制前列腺癌衍生细胞株的增殖(IC50＜1 μmol·L－1)，而对正常的人外周血液淋巴细胞作用较小(IC50值达到40 μmol·L－1)。

3.6 苯并呋喃-2 羧酸类化合物

Xiang 等［21］通过高通量筛选发现苯并呋喃-2羧酸类化合物(图8)有PIM 激酶抑制活性，例如化合物14(PIM-1，IC50=8.5 μmol·L－1)和化合物15(PIM-1，IC50=5.8 μmol·L－1)。化合物14的5 位溴和2 位羧基是活性必需基团，通过结构优化得到了高活性的PIM 激酶抑制剂，如化合物16(PIM-1，IC50= 0.020 μmol·L－1PIM-2，IC50=0.19 μmol·L－1)、化 合 物 17 (PIM-1，IC50=0.001 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.004 μmol·L－1)、化合物18(PIM-1，IC50= 0.019 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.066 μmol·L－1)。

Figure 8 Benzofuran-2-carboxylic acids as PIM kinase inhibitors

3.7 吡咯并咔唑类化合物

Akue-Gedu 等［22］发现了吡咯并［2，3-a］咔唑类PIM 激酶抑制剂(图9)。对66 种激酶进行活性筛选，发现化合物19 是最强的PIM 激酶抑制剂(PIM-1，IC50=0.12 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.51 μmol·L－1;PIM-3，IC50=0.01 μmol·L－1)。Letribot 等［23－24］在化合物19 的C 环N-10 上引入取代基，虽然抑制活性变化不大，但改善了化合物的渗透性。在人类纤维原代培养细胞(Fibro)和3 种实体瘤细胞株(PC3、DU145 和PA1)的体外实验中，这类化合物的抗增殖活性都在低微摩尔级，如化合物20(Fibro，IC50=0.63 μmol·L－1;PC3，IC50= 0.65 μmol·L－1;DU145，IC50=0.96 μmol·L－1;PA1，IC50=0.486 μmol·L－1)。Giraud 等［25］将化合物19 的C-3 位醛基去掉，并在C-4 位上引入了甲氧羰基得到了化合物21，其对PIM-1 和PIM-3 激酶有抑制活性(PIM-1，IC50=3 μmol·L－1;PIM-3，IC50=0.5 μmol·L－1)，且显示出微摩尔级的抗增殖活性(Fibro，IC50=8 μmol·L－1;PC3，IC50=6 μmol·L－1;DU145，IC50＞50 μmol·L－1;PA1，IC50=27 μmol·L－1)。

Figure 9 Pyrrolo［2，3-a］carbazoles as PIM kinase inhibitors

3.8 吲哚酮类化合物

Figure 10 Oxindoles as PIM kinase inhibitors

Haddach 等［26］通过高通量筛选发现吲哚酮类化合物(图10)具有PIM-1 激酶抑制活性，例如化合物22(PIM-1，IC50=0.386 μmol·L－1)。并且从同类化合物中发现，内酰胺的NH 作为氢键供体是PIM 激酶活性必需基团，在NH 上引入甲基PIM 激酶活性消失。吲哚环上5 位用氯原子取代可以加强PIM 激酶活性，而F 取代则活性降低。通过MV-4-11(人类AML 细胞)抗增殖活性筛选发现了活性更好的化合物23(PIM-1，IC50=5 nmol·L－1;PIM-2，IC50=25 nmol·L－1;PIM-3，IC50=16 nmol·L－1)。

4 结语

本文从结构特征、作用机制及小分子抑制剂的研究进展三个方面对PIM 激酶进行了总结。PIM 激酶通过多种机制影响肿瘤细胞的增殖和存活:PIM 激酶与转录因子协同作用，促进肿瘤细胞增殖;PIM 激酶也可通过磷酸化凋亡蛋白BAD和ASK1 来增加细胞存活;PIM 激酶通过调节多种细胞周期因子来调节细胞周期，诱导细胞的增殖;PIM 激酶通过调节细胞信号通路，增强细胞存活能力。总之，PIM 激酶在肿瘤的形成和发展过程中发挥着重要作用。尽管目前还没有PIM 激酶抑制剂上市，但关于小分子PIM 激酶抑制剂的研究越来越多，这些研究成果将推动新靶点抗肿瘤药物向前发展。

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