芦笋下脚料乙醇提取物免疫功能及活性成分研究

田颖刚，张 盼，黄宇玫，王春艳，朱 胜，乔娟娟，谢明勇,*

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学科学技术学院，江西 南昌 330029)

芦笋下脚料乙醇提取物免疫功能及活性成分研究

田颖刚1，张 盼1，黄宇玫2，王春艳1，朱 胜1，乔娟娟1，谢明勇1,*

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学科学技术学院，江西 南昌 330029)

用75%乙醇为溶媒，超声提取芦笋下脚料，获得提取物，对提取物中总皂苷、总多糖、总游离氨基酸含量进行分析；用体外细胞培养法观察该提取物对正常及ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响；以整体口服给药实验观察该提取物对正常小鼠免疫功能的影响，剂量分别为25、100、400mg/(kggd)，连续给药7d。结果表明：该提取物总皂苷含量高达18.20%、总多糖及总游离氨基酸含量分别为14.86%和12.63%；体外培养对脾淋巴细胞增殖无影响，但对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖呈低剂量促进高剂量抑制的作用；口服给药能增强小鼠碳廓清能力和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化增殖作用。芦笋下脚料乙醇提取物具有较明确的增强免疫功能的作用。

芦笋提取物；皂苷；多糖；游离氨基酸；免疫功能

芦笋(Asparagus officinalis Linne)又名石刁柏、龙须菜，为百合科多年生草本植物，具有特殊的营养和食疗功效，国际市场上享有蔬菜之王的美称[1]。芦笋含有多种活性成分，如芦笋多糖[2]、皂苷类化合物[3-4]、氨基酸[5]及黄酮类物质[6]等，具有抗肿瘤[7]、抗炎[8]、抗衰老[9]、免疫调节[10]等多种生物学功能。

近年来芦笋产业在我国迅猛发展，已成为世界上第一大芦笋生产国和出口国。目前我国芦笋除了供新鲜食用外，主要用于加工芦笋罐头和速冻产品，在加工过程中，每年产生大量的老茎和芦笋皮等下脚料。随着芦笋的大量种植，越来越多的芦笋下脚料如果不进行加工利用，任其自然腐败，既污染环境，又造成资源的浪费。有报道[11]称，这些下脚料中富含营养和功能活性成分，如：风干芦笋根中甾体皂苷元含量在1.2%以上；芦笋罐头下脚料中18种氨基酸含量达0.73%，必需氨基酸占总氨基酸的32.92%，粗多糖含量为0.41%[12]。为了使芦笋下脚料得到充分的利用，使之变废为宝，本实验采用75%乙醇从芦笋下脚料获得提取物，并对总皂苷、总多糖及总游离氨基酸含量进行分析，采用体外细胞培养及整体动物实验，分析芦笋醇提物对机体免疫功能的影响，为充分利用芦笋资源及延伸芦笋产业提供一定的理论依据和参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与试剂

实验动物：雄性Balb/C小鼠，体质量18～22g，购自南昌大学医学院实验动物中心。

芦笋下脚料为田间采收的绿芦笋嫩茎，经整理切割后，不作商品芦笋使用的剩余物，秦皇岛长胜农业科技发展有限公司提供(采收时间，2011年5月)，新鲜样品干燥后粉碎至20目备用；人参总皂苷(总皂苷含量＞95%)南昌大学食品科学与技术国家重点实验室自制。

菝葜皂苷元标准品、葡萄糖标准品、天冬氨酸标准品 中国药品生物制品检定所；RPMI1640细胞培养液北京索莱宝科技有限公司；新生牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；刀豆蛋白A(ConA)、噻唑蓝(MTT) 美国Sigma公司；印度墨水 北京索莱宝科技有限公司；24、96孔细胞培养板(平底) 美国Costor公司。

1.2 仪器与设备

MK3酶标仪 上海热电仪器有限公司；IDX-35B型高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；超净工作台 厦门精艺兴业有限公司；KQ3200E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；SENCO R系列旋转蒸发器 上海申生科技有限公司；BDS200倒置显微镜 北京福凯仪器有限公司；WJ-80A-111二氧化碳培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；UV2800紫外-可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芦笋下脚料乙醇提取物的制备

称取60℃真空干燥至质量恒定的芦笋下脚料5g，以50mL 75%乙醇60℃超声回流30min，超声功率为150W。过滤取滤液，重复此步骤3次，浓缩、真空干燥至质量恒定，得芦笋乙醇提取物(得率约为31%)。

1.3.2 芦笋下脚料乙醇提取物的成分分析

芦笋乙醇提取物中总皂苷含量的测定采用香草醛-高氯酸法[13]：精确吸取各质量浓度菝葜皂苷元标准品甲醇溶液(0、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4mg/mL)0.5mL，70℃水浴挥干溶剂，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，摇匀密封，于70℃水浴15min，取出，立即用冷水冷却，加入5mL的冰乙酸，摇匀，反应5min，以溶剂作空白，于波长535nm处测吸光度，以吸光度(A)对菝葜皂苷元质量浓度(ρ)绘制标准曲线。称取0.40mg干燥至质量恒定的芦笋乙醇提取物溶解于10mL甲醇中，按上述步骤操作。根据标准曲线计算提取物中的总皂苷含量。

总多糖含量采用蒽酮-硫酸法测定[14]：精密量取不同质量浓度葡萄糖对照品水溶液(0、0.018、0.036、0.054、0.09、0.108mg/mL)各1.0mL于10mL玻璃离心管中，分别加入0.2%蒽酮-硫酸试剂4mL，混匀，立即置冰水浴中冷却5min，取出后置沸水浴中加热10min，取出，置冷水流中冷却至室温。以溶剂为空白，于波长626nm处测定吸收度，以吸光度(A)对葡萄糖质量浓度(ρ)绘制标准曲线。称取0.40mg干燥至质量恒定的芦笋乙醇提取物溶解于10mL蒸馏水中，按上述步骤操作。根据标准曲线计算提取物中的总多糖含量。

总游离氨基酸采用茚三酮法测定[15]：分别精密量取不同质量浓度天冬氨酸标准品水溶液(0、0.015、0.03、0.045、0.09 mg/mL)各1.0mL于10mL量瓶中，分别加入醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.5)2mL和3%茚三酮70%乙醇溶液1mL，混匀，沸水浴加热15min，取出，冷却至室温，加水定容至刻度，摇匀。以溶剂为空白，在570nm波长处测定吸收度，以吸光度(A)对天冬氨酸质量浓度(ρ)绘制标准曲线。称取0.40mg干燥至质量恒定的芦笋乙醇提取物溶解于10mL蒸馏水中，按上述步骤操作。根据标准曲线计算提取物中的总游离氨基酸含量。

1.3.3 实验分组及剂量设置

取Balb/C小鼠，按体质量随机分为5组(每组小鼠15只)，分别灌服芦笋乙醇提取物低、中、高剂量水溶液、生理盐水及人参皂苷水溶液。芦笋提取物低、中、高剂量分别按25、100、400(kggd)灌胃，人参皂苷(阳性对照)按12.5mg/kg灌胃，空白对照组灌服同体积生理盐水。每日给药1次，连续7d。

1.3.4 小鼠免疫器官指数测定

各实验组小鼠末次灌胃给药后，禁食12h，每组小鼠15只。称质量，颈椎脱臼处死，取其脾脏及胸腺称质量，计算脾脏指数(脾脏质量/体质量)及胸腺指数(胸腺质量/体质量)。

1.3.5 芦笋乙醇提取物对体外培养的小鼠脾淋巴细胞的影响

1.3.5.1 脾细胞悬液的制备

小鼠无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心5min(1000r/min)。弃上清，加3mL Tris-NH4Cl红细胞裂解液轻轻吹匀，以1000r/min离心5min，弃上清。如仍有红细胞重复此操作。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台盼蓝染色计数活细胞数(应在95%以上)，调整细胞浓度为3h106个/mL。

1.3.5.2 芦笋乙醇提取物对体外培养的正常及ConA诱导脾淋巴细胞转化增殖的影响

取24孔细胞培养板，每孔加0.5mL脾细胞悬液，另依次加入0.5mL的含不同终质量浓度芦笋提取物(0、1、5、20、100、500、1100、2200µg/mL)的RPMI 1640完全培养液，每孔设6个复孔，其中3复孔每孔加入75µL ConA液(相当于7.5µg/mL)，其余各孔加等量的完全培养液。置5% CO2，37℃ CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装4孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，于490nm波长测定光密度值。

1.3.6 芦笋乙醇提取物口服给药对小鼠脾淋巴细胞转化增殖的影响

各实验组小鼠末次灌胃给药30min后，分别无菌取脾，每组小鼠15只。按1.3.5节方法制备单细胞悬液。以每孔1mL细胞悬液加入24孔培养板中，每样本设2复孔加75μL ConA液(相当于7.5µg/mL)，另两复孔加等量RPMI 1640完全培养液作为对照，置5% CO2，37℃二氧化碳孵箱中培养72h。MTT检测方法同上。按式(1)计算脾淋巴细胞刺激指数(SI)[16]。

式中：OD1为ConA诱导的脾淋巴细胞光密度；OD2为不加ConA的脾淋巴细胞光密度。

1.3.7 小鼠碳廓清实验

各实验组小鼠末次灌胃给药30min后，称体质量，每组小鼠15只。从小鼠尾静脉注入稀释6倍的印度墨汁，按每10g体质量0.1mL计。待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后3、11min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到 2mL 0.1g/100mL Na2CO3溶液中。用分光光度计于600nm波长处测光密度，以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称质量。

以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按式(2)、(3)计算吞噬指数α。

式中：OD1为注射墨水3min的光密度值；OD2为注射墨水11min的光密度值；t1为注射墨水后第1次取血时间即3min；t2为注射墨水后第2次取血时间即11min。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 芦笋下脚料乙醇提取物的成分分析

由表1可以看出，芦笋下脚料经乙醇提取后，富含皂苷、多糖、总游离氨基酸等活性成分，其中芦笋总皂苷含量高达18.20%，表明乙醇提取能较好地富集芦笋活性成分。

表 1 芦笋乙醇提取物中活性成分含量(x±s,n＝3)Table 1 Active components in ethanol extract from asparagus scraps (x±s,n＝3)

2.2 芦笋乙醇提取物对小鼠免疫器官的影响

表 2 芦笋乙醇提取物对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响(±s,n＝3)Table 2 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on spleen index and thymus index in mice (±s,n＝3)

表 2 芦笋乙醇提取物对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响(±s,n＝3)Table 2 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on spleen index and thymus index in mice (±s,n＝3)

注：*.与空白对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)；**.与空白对照组相比，有极显著性差异(P＜0.01)。下同。

2.47f0.85 3.33f0.86* 3.09f0.60* 3.35f0.60** 3.32f0.74*组别剂量/(mg/(kggd))体质量/g脾脏指数胸腺指数空白对照组芦笋乙醇提取物低剂量组芦笋乙醇提取物中剂量组芦笋乙醇提取物高剂量组阳性对照组25 100 400 12.5 24.96f2.87 23.34f3.30 24.57f1.07 26.71f1.89 26.08f1.90 4.67f0.87 5.63f1.30* 5.50f0.94* 6.53f0.94** 5.95f1.13**

表2显示，芦笋乙醇提取物各剂量组及阳性(人参皂苷)对照组小鼠连续灌服芦笋乙醇提取物7d，体质量与空白对照组相比无显著差异，提示该芦笋乙醇提取物对小鼠体质量无影响。

与空白对照组相比，芦笋乙醇提取物低、中剂量组的脾脏指数及胸腺指数及人参皂苷组的胸腺指数有显著性差异(P＜0.05)，高剂量组的脾脏指数及胸腺指数及阳性对照组的脾脏指数有极显著差异(P＜0.01)，表明芦笋乙醇提取物和人参皂苷均可以增强实验小鼠脾脏指数及胸腺指数，且芦笋乙醇提取物有随剂量增加而增大的趋势。

2.3 芦笋乙醇提取物对体外培养的小鼠脾淋巴细胞转化增殖的影响

脾脏是机体内最大的外周免疫器官，也是T/B淋巴细胞定居和接受抗原刺激产生免疫应答的重要场所。T淋巴细胞是介导机体细胞免疫的重要细胞，ConA等有丝分裂原能非特异性地诱导 T 细胞活化，导致细胞因子合成及细胞因子受体表达。可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白与核酸合成增加，并进行分裂增殖。根据T淋巴细胞转化增殖程度，可反映机体细胞免疫水平。

图1显示，芦笋乙醇提取物各质量浓度条件下的体外培养的正常的脾淋巴细胞OD490nm值相近且与空白对照组相同，表明芦笋乙醇提取物对体外培养的正常的脾淋巴细胞转化增殖无促进和抑制作用，而加ConA诱导以后，各药物质量浓度及对照组脾淋巴细胞OD490nm值较不加ConA诱导组皆明显升高，且随芦笋乙醇提取物剂量的升高其OD490nm值逐渐下降，当芦笋乙醇提取物质量浓度≥500µg/mL时，呈显著性差异(P＜0.05)，表明芦笋乙醇提取物对ConA诱导的脾淋巴细胞转化增殖呈低质量浓度促进，高质量浓度抑制的双向调节作用。

图 1 芦笋乙醇提取物对体外培养的脾淋巴细胞的影响(x±s)Fig.1 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on the proliferation of spleen lymphocytes in vitro(x±s)

2.4 不同剂量芦笋乙醇提取物口服给药对小鼠脾淋巴细胞转化增殖的的影响

表 3 芦笋乙醇提取物对小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力的影响(±s,n＝3)Table 3 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on the proliferation of spleen lymphocytes in mice (±s, n＝3)

表 3 芦笋乙醇提取物对小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力的影响(±s,n＝3)Table 3 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on the proliferation of spleen lymphocytes in mice (±s, n＝3)

组别剂量/(mg/(kggd))脾淋巴细胞刺激指数(SI)空白对照组芦笋乙醇提取物低剂量组芦笋乙醇提取物中剂量组芦笋乙醇提取物高剂量组阳性对照组25 100 400 12.5 2.309f0.459 3.195f1.123* 3.307f0.976** 3.670f1.781* 3.204f1.312*

表3显示，芦笋乙醇提取物低、高剂量组及阳性对照组(人参皂苷)淋巴细胞转化增殖能力与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，中剂量组有极显著差异(P＜0.01)，表明芦笋乙醇提取物可以增强刀豆蛋白诱导的小鼠脾淋巴细胞的转化增殖，具有提高细胞免疫的功能。整体实验药物经口服进入机体后，受体内完整统一的内环境、各种神经体液调节相互作用，而体外实验药物直接作用于细胞，失去了及各种组织与细胞的相互作用及体内各种复杂因素干扰，所以体外实验中药物对细胞影响更为单一和显著，由图1和表3可以看出，芦笋乙醇提取物对整体及体外实验中ConA诱导的脾淋巴细胞增殖的影响具有一定的吻合性，即两者都有最合适的转化增殖有效浓度，并非剂量越大转化增殖效果越显著。

2.5 芦笋乙醇提取物对小鼠碳廓清能力的影响

表 4 芦笋乙醇提取物对小鼠碳廓清能力的影响(±s, n＝3)Table 4 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on carbon clearance index in mice±s, n＝3)

表 4 芦笋乙醇提取物对小鼠碳廓清能力的影响(±s, n＝3)Table 4 Effect of ethanol extract from asparagus scraps on carbon clearance index in mice±s, n＝3)

组别剂量/(mg/(kggd))吞噬指数(α)空白对照组芦笋乙醇提取物低剂量组芦笋乙醇提取物中剂量组芦笋乙醇提取物高剂量组阳性对照组25 100 400 12.5 4.499f0.783 5.723f0.875** 5.312f0.854* 5.074f0.645 5.318f0.982*

由表4可见，与空白对照组相比，芦笋乙醇提取物低剂量组的吞噬指数有极显著性差异(P＜0.01)，中剂量组有显著性差异(P＜0.05)，芦笋乙醇提取物高剂量组虽有增强趋势，但无统计学差异(P＞0.05)，阳性对照组有显著的差异。提示芦笋乙醇提取物在一定有效剂量前提下，具有增强单核-巨噬细胞吞噬功能的作用，但随剂量增加，有作用减弱的趋势。

芦笋乙醇提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖及碳廓清能力调节效应的剂量关系，为芦笋下脚料提取物及芦笋下脚料的深入开发利用提供了一定的实验基础，在开发相关产品时要注意芦笋提取物的添加使用量并非越多越好。

3 结 论

本实验采用乙醇对芦笋下脚料进行提取，制备得到的乙醇提取物中皂苷含量为18.20%、多糖含量为14.86%及总游离氨基酸含量为12.63%，说明采用乙醇提取可较好地富集芦笋下脚料中活性物质。体外实验表明该提取物对脾淋巴细胞增殖无影响，但对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖呈低剂量促进、高剂量抑制的作用，整体实验显示该提取物明显提高ConA诱导脾淋巴细胞转化增殖作用，显著增强小鼠碳廓清能力，使细胞和体液免疫能力加强，具有提高和调节免疫功能的作用。综上所述，本实验制备获得的芦笋下脚料乙醇提取物具有较高应用价值。

[1] 李正应. 稀有蔬菜栽培[M]. 北京: 科学文献出版社, 1997: 265-266.

[2] YAMAMORI A, ONODERA S, KIKUCHI M, et al. Two novel oligosaccharides formed by 1F-fructosyltransferase purified from roots of Aspаrаgus off i cinаlis L.[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2002, 66: 1419-1422.

[3] WANG Liwei, ZHAO Bing, HUANG Yunxiang. Determination of diosgenin in asparagus officinalis byproduct by RP-HPLC[J]. Medicinal Plant, 2011, 2(1): 42-44.

[4] HAYES P Y, JAHIDIN A H, LEHMANN R, et al. Steroidal saponins from the roots of Asparagus racemosus[J]. Phytochemistry, 2008, 69: 796-804.

[5] 刘升一, 王雪耘, 李丽莉, 等. 芦笋中氨基酸和微量元素锌、铜、铁、锰、硒含量测定[J]. 营养学报, 1990, 12(3): 328-329.

[6] FUENTES-ALVENTOSA J M, JARAMILLO S, RODRIGUEZGUTIERREZ G, et al. Flavonoid profile of green asparagus genotypes[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56: 6977-6984.

[7] 夏俊, 陈治文, 胡守芬, 等. 芦笋提取物抑制恶性黑色素瘤A375细胞增值的研究[J]. 蚌埠医学院学报, 2004, 29(2): 95-97.

[8] LEE D Y, CHOO B K, YOON T, et al. Anti-inf l ammatory effects of Asparagus cochinchinensis extract in acute and chronic cutaneous inf l ammation[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2009, 121: 28-34.

[9] 苗明三, 顾丽亚, 方晓燕, 等. 芦笋多糖对衰老模型小鼠的影响[J].中国中药杂志, 2004, 29(7): 673-675.

[10] GAUTAM M, SAHA S, BANI S, et al. Immunomodulatory activity of Asparagus racemosus on systemic Th1/Th2 immunity: implications for immunoadjuvant potential[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2009, 121: 241-247.

[11] 李长秀, 张铁垣, 陈维杰. 芦笋根中菝葜皂苷元的气相色谱测定[J].分析测试学报, 1995, 14(1): 61-64.

[12] 高文庚, 王红, 武爱国. 芦笋罐头加工下脚料营养成分分析[J]. 中国农村小康科技, 2007(1): 73-75.

[13] 孙健, 李曼, 王丽卫, 等. 芦笋下脚料皂苷超声提取工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(14): 152-154.

[14] 付志红, 谢明勇, 聂少平, 等. 不同品种车前子中多糖含量比较[J].中国中药杂志, 2004, 29(6): 581-582.

[15] 黄松, 吴月娜, 刘梅, 等. 茚三酮比色法测定青天葵中总游离氨基酸的含量[J]. 中国中医药信息杂志, 2010, 17(12): 50-52.

[16] GARTNER L, WILHELM J A, CZIESCHNEK R. in vitro stimulation of lymphocytes by different strains of cytomegalovirus l[J]. Medical Microbiology and Immunology, 1982, 171: 53-57.

Immunoregulatory Functions and Active Components of Ethanol Extract from Asparagus Scraps

TIAN Ying-gang1，ZHANG Pan1，HUANG Yu-mei2，WANG Chun-yan1，ZHU Sheng1，QIAO Juan-juan1， XIE Ming-yong1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. College of Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330029, China)

In this study, 75% ethanol extract from asparagus scraps obtained by ultrasonic-assisted extraction was analyzed for the contents of total saponins, total polysaccharides and free amino acids. Meanwhile, its in vitro effect on the normal and Con A-induced proliferation of mouse spleen lymphocytes was studied, and the effect of oral administration at doses of 25, 100 mg/kg and 400 mg/kg on immune functions in normal mice was also observed. The ethanol extract contained 18.20% total saponins, 14.86% total polysaccharides and 12.63% free amino acids. It had no inf l uence on normal spleen lymphocytes in vitro, whereas the ConA-induced proliferation of spleen lymphocytes could be promoted at 25 mg/kg but suppressed at 400 mg/kg by it. Oral administration of this extract enhanced carbon clearance capacity in mice and the ConA-induced proliferation of spleen lymphocytes. Therefore, this asparagus extract has remarkable immunoenhancing functions.

asparagus extract；saponin；polysaccharide；free amino acid；immune function

TS201.4

A

1002-6630(2013)01-0277-04

2011-11-08

国家公益性行业(农业)科研专项(201003074-5)

田颖刚(1972ü)，男，副研究员，博士，研究方向为食品化学与营养。E-mail： tianyinggang@yahoo.cn

*通信作者：谢明勇(1957ü)，男，教授，博士，研究方向为食品化学、食品营养与安全。E-mail： myxie@ncu.edu.cn