冷却猪肉优势腐败菌分离鉴定及致腐能力测定

黄 林，陈全胜，张燕华，毕夏坤，许 慧，赵杰文,*

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江西农业大学生物科学与工程学院，江西 南昌 330045)

冷却猪肉优势腐败菌分离鉴定及致腐能力测定

黄 林1,2，陈全胜1，张燕华1，毕夏坤1，许 慧1，赵杰文1,*

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江西农业大学生物科学与工程学院，江西 南昌 330045)

分离鉴定冷却猪肉中的优势腐败菌并测定其致腐能力，以研究冷却肉腐败机理。利用选择性培养基和感官评定方法，从变质冷却猪肉中分离筛选出优势腐败菌并鉴定到种。再将各优势腐败菌接种到灭菌肉块上，4℃贮藏下定期测定各腐败菌的菌落数和挥发性盐基氮(TVB-N)，并以TVB-N产量因子(YTVB-N)衡量各腐败菌的致腐能力。结果表明：经选择性培养基分离和肉样感官评定共筛选得到5株优势腐败菌即P3、PS1、J4、P5和S5，分别鉴定为Acinetobacter guillouiae、Pseudomonas koreensis、Bacillus fusiformis、Enterobacter cloacae和Brochothrix thermosphacta。进一步研究其腐败特性发现，4℃贮藏时接种优势腐败菌的肉样在第7天已明显腐败。PS1的TVB-N和YTVB-N明显高于其他菌株。研究表明，从冷却猪肉分离鉴定出的优势腐败菌中，PS1导致冷却猪肉腐败能力较强。

冷却猪肉；优势腐败菌；分离；鉴定；致腐能力

冷却猪肉能够最大程度地保持肉品风味和营养价值，在我国大中城市已经逐步成为生鲜肉消费的主流。冷却猪肉在冷藏过程中仍会腐败变质，主要是由于微生物大量繁殖造成的，而且各种腐败微生物竞争能力与代谢特征的差异会造成肉质腐败的时间和特征不同，因此有必要开展冷却猪肉中优势腐败菌腐败特性的研究。大量研究表明，假单胞菌属、肠杆菌科、不动杆菌属、乳酸菌和热杀索丝菌是引起冷却猪肉腐败变质的主要菌群[1-7]。在冷却肉的初始菌相中假单胞菌占25%～26%，乳酸菌占20%～21%，微球菌和葡萄球菌属占12%～15%，热死环丝菌占12%～13%，肠杆菌科在19%～25%之间，但不同种类冷却肉由于其屠宰工艺和理化特性不同，因而导致其腐败的微生物种类和比例也会不同[8]。

目前研究主要集中在调查肉及肉制品中腐败菌菌相的分布与变化方面，而在肉品具体致腐菌的鉴别及其腐败能力方面相关研究较少，鉴于此，本研究着重以冷却猪肉为研究对象，从中分离筛选出优势腐败菌并对其鉴别，再将它们回接至灭菌猪肉，4℃贮藏条件下定期检测肉样理化指标，并以产量因子(YTVB-N)定量描述冷却猪肉优势腐败菌的腐败能力，确定其中的主要腐败菌，为开展冷却猪肉主要腐败菌腐败机理及生长动力学研究打下基础，以便有针对性地对冷却猪肉中的优势腐败菌加以控制，为冷却猪肉的保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用猪肉为当天屠宰的取自猪身上的冷却里脊肉，购于江苏镇江欧尚超市肉制品专柜。

1.2 培养基与试剂

选择培养基[5,9]：营养琼脂培养基、PSA培养基、VRBGA培养基、STAA培养基。

用于PCR扩增的全套试剂和扩增引物 生工生物工程(上海)股份有限公司；氧化镁、硼酸、盐酸(均为分析纯) 江苏镇江华东器化玻有限公司。

1.3 仪器与设备

YX400Z高压灭菌锅 上海安锐自动化仪表有限公司；VS-300型洁净工作台 苏州鸿基洁净科技有限公司；凝胶成像系统 Alpha Innotech公司；PTC-200 PCR扩增仪 美国MJ Research公司。

1.4 方法

1.4.1 冷却猪肉腐败菌的分离纯化

无菌操作从变质冷却猪肉表面取样10g，无菌剪刀剪碎，放入90mL无菌生理盐水中，封口后120r/min振摇30min，取上清液进行10倍稀释，选择3个合适稀释度，每个稀释度做3个重复，倾注含有不同选择培养基的平板适温培养。然后挑取各种典型生长的菌落，反复进行平板划线分离，得到纯化的单菌落，转接于相应培养基斜面保存备用。

1.4.2 优势腐败菌的筛选

将分离纯化的各菌株重新培养24h后，用无菌水分别制成菌悬液，摇匀，涂片染色显微直接计数法测定菌液浓度[9]，调整菌体浓度为104～105CFU/mL。再在洁净工作台中将冷却猪肉用酒精灯进行表面灭菌，并以压片法镜检，确认该灭菌操作良好。然后分割成20g左右厚度均匀的小块，浸泡于104～105CFU/mL菌液中，10s后取出放于无菌塑料袋中，每个菌株接种2个肉块，以未接种腐败菌的肉块作对照，4℃冰箱保存。每天对肉块进行感官评定比较[5,10]，以腐败最快肉样接种的菌株作为初筛腐败菌，选取其中优势腐败菌进行菌种鉴定及致腐能力的测定，进一步研究其致腐特性。

1.4.3 优势腐败菌的鉴定

1.4.3.1 菌落特征和菌体形态特征观察

观察初筛所得优势腐败菌单菌落的形态。并挑取培养18～24h长势好的单菌落，通过革兰氏染色、鞭毛染色和芽孢染色观察细胞个体形态。

1.4.3.2 生理生化实验

根据Brown[11]推荐的肉品微生物鉴定图谱，结合常见细菌系统鉴定手册[12]进行氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化发酵(O/F)和精氨酸双水解酶实验。

1.4.3.3 菌株的分子鉴定[13]

挑取培养18～24h单菌落用无菌ddH2O制成菌悬液，10000r/min离心10min，弃上清，加入100μL ddH2O，制得模板DNA，并采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)扩增菌株的16S rRNA基因[14]。以模板DNA 2μL、GoTaq Green Master Mix(2h)25μL、27F上游引物1μL、1541R下游引物1μL和ddH2O 21μL为PCR反应体系。95℃预变性5min，然后95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min 30s完成30个循环。再用1hTAE配制1%琼脂糖凝胶，以DNA green为分子质量标准，取5μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统拍摄记录电泳图。最后将PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。并登录NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)，将所得序列与数据库已知序列进行比对，获得相似性99%以上的菌株序列，使用MEGA 5.04软件构建Neighbor-Joining系统发育树。

1.4.4 优势腐败菌致腐能力的测定[5,15]

将初筛菌株按方法1.4.2节制成菌液接种至灭菌肉块放于无菌袋中，以未接腐败菌肉块作对照，4℃冰箱保存。于第1、2、4、6、8天各取2个肉样进行菌落数[16]和挥发性盐基氮(TVB-N)测定(半微量定氮法)[17]。并以TVB-N产量因子(YTVB-N)作为各种腐败菌腐败能力的定量指标。

YTVB-N/(mg TVB-N/CFU)=

2 结果与分析

2.1 优势腐败菌的分离筛选

将变质冷却猪肉稀释液涂布不同选择性培养基培养，从中挑选具有典型特征的菌落28株，经纯化后制成菌液，接种至灭菌冷却猪肉进行致腐实验，通过感官评定比较，发现接种菌株J4、PS1、S5、P3和P5的5个肉样腐败较快，前3d颜色略转为红色，失去光泽，略有异味；第5天开始闻到臭味，颜色变暗，表面变软失去弹性并开始有黏液；第7天具有较强腐臭味，肉样呈暗红色，表面软烂且黏液丰富，肉样已明显腐败。不同微生物因其生物学特征及利用肉中营养物质的能力不同，造成肉质腐败快慢的不同，表明其对猪肉的致腐能力也有所差异。由此，筛选得到引起肉样腐败较快的5个优势腐败菌株J4、PS1、S5、P3和P5，进一步研究其生物学特征和腐败特性。

2.2 优势腐败菌的鉴定

2.2.1 形态特征和生理生化特征

通过选择性培养基和感官评定筛选得到的5个优势腐败菌，观察其菌落特征、形态特征和部分生理生化特征，结果见表1。

根据Brown推荐的肉品微生物鉴定图谱，并结合常见细菌系统鉴定手册中的鉴定分类系统，由表1结果可以初步判定，J4为芽孢杆菌属，PS1为假单胞菌属，S5为索丝菌属，P3和P5为肠杆菌科。

2.2.2 优势腐败菌16S rRNA的PCR扩增与系统发育树的构建

表 1 各种优势腐败菌的菌落特征、形态特征和部分生理生化特征Table 1 Colonial, morphological and physiological characteristics of dominant spoilage bacteria

图 1 5个菌株的16S rRNA PCR扩增产物电泳图谱Fig.1 Electropherogram of PCR amplif i cation products of 16S rRNA genes from fi ve strains

图 2 基于16S rRNA序列同源性的5株细菌系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the fi ve strains based on 16S rRNA sequences

由图1可知，将筛选得到的5个优势腐败菌以总DNA为模板PCR扩增后经电泳检测，均得到了1.5kb左右的条带。并将PCR扩增产物送至上海生工公司进行测序，测得它们的16S rRNA序列并与GenBank数据库已有的序列比对，选取同源性在99%以上的菌株序列构建系统发育树，结果见图2。由系统发育树结合菌落特征、形态特征和生理生化特征可以看出：P3与不动杆菌属的Acinetobacter guillouiae亲缘关系最近，P5与肠杆菌属的Enterobacter cloacae亲缘关系最近，PS1与假单胞菌属的Pseudomonas koreensis亲缘关系最近，J4与芽孢杆菌属的Bacillus fusiformis亲缘关系最近，S5与索丝菌属的Brochothrix thermosphacta亲缘关系最近。故该5株优势腐败菌分别鉴定为Acinetobacter guillouiae P3、Pseudomonas koreensis PS1、Bacillus fusiformis J4、Enterobacter cloacae P5和Brochothrix thermosphacta S5。

Acinetobacter guillouiae在有氧条件下感染到肉品中能引起肉质腐败，主要利用氨基酸作为生长基质，不产生异味的代谢产物，其致腐能力较低。Enterobacter cloacae广泛存在于自然界中，感染到肉样表面后，在有氧条件下利用葡萄糖和6-磷酸葡萄糖生长，并分别以分解氨基酸产生异味的腐胺和尸胺等胺类物质。Pseudomonas koreensis存在于土壤中，在冷却牛肉中也曾被分离到，能较强地利用肌氨酸和肌氨酸酐，是冷却肉中的优势腐败菌[18]。Bacillus fusiformis属于芽孢杆菌属，是一种好氧性、可以形成芽孢的革兰氏阳性杆菌，广泛分布于土壤和污水中，能利用糖类、蛋白质等营养成分生长，是引起食品腐败变质的常见污染菌。Brochothrix thermosphacta能利用葡萄糖作为生长底物，在有氧条件下生成乙酸及乙偶姻，产生甜的异味，并能分解亮氨酸和缬氨酸产生挥发性酸，在微氧条件下可能成为主要的腐败菌[19]。这些腐败菌可能是因为猪肉在屠宰、运输和销售过程中污染并在4℃低温贮藏过程中繁殖逐渐成为优势腐败菌。

2.3 优势腐败菌接种灭菌冷却猪肉后菌落总数和TVB-N的变化

将初筛得到的5个优势腐败菌回接至冷却猪肉，4℃贮藏条件下定期取样测定菌数繁殖和TVB-N变化，见图3、4。

图 3 各种优势腐败菌菌落数变化Fig.3 Growth curve of dominant spoilage bacteria inoculated to sterilized pork

图 4 接种各种优势腐败菌对TVB-N值的影响Fig.4 Effect of dominant spoilage bacteria on TVB-N value in pork

微生物的生长繁殖是引起肉质腐败的主要原因，因此微生物的数量是衡量肉质腐败程度的一个重要指标。而TVB-N是由于肉类在微生物作用下，分泌一系列酶引起的脱氨、脱羧作用，导致蛋白质分解而形成的产物，是评价肉质新鲜度最重要的指标。由图3可知，贮藏过程中各腐败优势菌和对照组菌落数均呈增加趋势，且在第5天进入稳定期，各优势腐败菌菌落数均超过9.0(lg(CFU/g))，显著大于对照组菌落数8.30(lg(CFU/g)) (P＜0.05)。说明接种至肉样中的各优势腐败菌及肉样自身所带的细菌，在4℃低温下仍能利用猪肉中糖类和蛋白质等营养物质迅速生长繁殖，菌数明显增加，但随着氧气和营养物的消耗及生物胺、有机酸等代谢产物的累积，导致菌体增长减慢并进入稳定期。图4表明，TVB-N值在第1天后才明显增加，在第3天均达到15mg/100g以上，到第7天接近25mg/100g，肉质达到腐败程度，且接种优势腐败菌各组肉样的TVB-N值在第3天后均显著高于对照组(P＜0.05)，说明腐败菌的生长繁殖是导致TVB-N产生的主要原因。且各腐败菌在利用肉质糖分后才进一步分解蛋白质而产生生物胺，并随着菌数的增加，生成的生物胺也快速增加，但在第3天后因为生物胺及有机酸的累积反馈抑制了生物胺的形成，从而导致生物胺的增长速度有所减缓。这与Jiang Yun[7]、黎园园[10]等研究肉中腐败微生物生长及TVB-N产生状况基本一致。这些规律可为控制冷却猪肉中的优势腐败菌，保障肉品质量提供理论依据。

2.4 优势腐败菌腐败能力定量分析

不同腐败菌利用肉中的营养物质产生代谢产物有所不同，本实验以TVB-N产量因子(YTVB-N)作为各优势腐败菌腐败能力的定量分析指标，结果见表2。

表 2 各种优势腐败菌的TVB-N产量因子Table 2 Yield factors of TVB-N of dominant spoilage bacteria

有研究表明，测定菌株的腐败能力和产生异臭味的能力是可以确定肉类腐败菌的一种方法。腐败代谢产物的产量因子可作为评价肉类腐败菌腐败能力的定量指标，可选择三甲胺(TMA)、TVB-N、组胺或其他可能与腐败有关的代谢产物的产量因子作为评价指标[15,20-21]。由表2可知，接种菌株PS1(Pseudomonas koreensis)肉样的YTVB-N明显高于其他菌株，而菌株P5(Enterobacter cloacae)的YTVB-N相对较低。由于不同腐败菌利用分解肉品中蛋白质产生的代谢物不同，引起肉品腐败的程度和特性的不同。TVB-N含量是目前评价肉品新鲜度的国家标准[17]，而YTVB-N可定量地表示每种优势腐败菌在相同时间内产生TVB-N的量，由此可反映不同优势腐败菌导致猪肉腐败能力的差异。研究表明P. koreensis PS1导致冷却猪肉腐败能力较强，B. fusiformis J4和B. thermosphacta S5导致腐败也比较快，而A. guillouiae P3和E. cloacae P5腐败能力较弱。

3 结 论

本研究从冷却变质猪肉中分离并通过感官评定比较筛选得到5株优势腐败菌，结合形态、生理生化特征及16S rRNA分子鉴定方法，分别鉴定为Acinetobacter guillouiae P3、Pseudomonas koreensis PS1、Bacillus fusiformis J4、Enterobacter cloacae P5和Brochothrix thermosphacta S5。

将筛选得到的5个优势腐败菌接种到灭菌肉块中，4℃贮藏条件下比较各腐败菌菌落数和TVB-N的增长情况及TVB-N产量因子(YTVB-N)，研究表明P. koreensis PS1导致冷却猪肉腐败能力较强，B. fusiformis J4和B. thermosphacta S5导致腐败也较快，而A. guillouiae P3和E. cloacae P5腐败能力较弱。

[1] GILL C O, BRYANT J. The contamination of pork with spoilage bacteria during commercial dressing, chilling and cutting of pigcarcasses[J]. International Journal of Food Microbiology, 1992, 16(1): 51-62.

[2] BORCH E, KANT-MUEMANSB M. Bacterial spoilage of meat and cured meat products[J]. International Journal of Food Microbiology, 1996, 33(1): 103-120.

[3] LI Miaoyun, ZHOU Guanghong, XU Xinglian, et al. Changes of bacterial diversity and main fl ora in chilled pork during storage using PCR-DGGE[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 23(7): 607-611.

[4] 傅鹏, 李平兰. 冷却猪肉初始菌相分析与冷藏过程中的菌相变化规律研究[J]. 食品科学, 2006, 27(11): 119-124.

[5] 彭勇. 冷却猪肉常见腐败微生物致腐能力的研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2005.

[6] 江芸, 高峰, 徐幸莲, 等. 冷却猪肉不同前处理对细菌DNA提取及PCR-DGGE的影响[J]. 食品科学, 2010, 31(6): 258-262.

[7] JIANG Yun, GAO Feng, XU Xinglian, et al. Changes in the composition of the bacterial fl ora on tray-packaged pork during chilled storage analyzed by PCR-DGGE and real-time PCR[J]. Journal of Food Science, 2011, 76(1): 27-33.

[8] 马俪珍, 南庆贤, 戴瑞彤. 冷却猪肉中腐败菌的分离、初步鉴定与初始菌相分析[J]. 天津农学院学报, 2005, 12(3): 39-43.

[9] 范秀容, 沈萍, 李广武. 微生物学实验[M]. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2004.

[10] 黎园园, 董庆利, 梁娜, 等. 解冻猪肉中优势腐败菌致腐能力研究[J].食品科学, 2011, 32(5): 123-127.

[11] BROWN M H. Meat microbiology[M]. New York: Applied Science Publishers Ltd., 1982: 474-475.

[12] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001.

[13] OLSSON C, AHRNÈ S, PETTERSSON B, et al. The bacterial fl ora of fresh and chill-stored pork: analysis by cloning and sequencing of 16S rRNA genes[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 25(3): 245-252.

[14] 祝莹, 董英, 肖香. 镇江肴肉中腐败菌的初步分离鉴定[J]. 中国食品学报, 2011, 11(2): 197-201.

[15] 许振伟, 许钟, 杨宪时, 等. 大黄鱼中复合腐败菌腐败能力的分析[J].食品科学, 2010, 31(23): 118-122.

[16] GB/T 4789.2ü2010食品卫生微生物学检验菌落总数测定[S]. 北京:中国标准出版社, 2010.

[17] GB/T 5009.44ü2003肉与肉制品卫生标准的分析方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.

[18] OLOFSSON T C, AHRNÈ S, MOLIN G. Composition of the bacterial population of refrigerated beef, identif i ed with direct 16S rRNA gene analysis and pure culture technique[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 118(3): 233-240.

[19] DAINTY R H, HIBBARD C. Aerobic metabolism of Brochothrix thermosphacta growing on meat surface and in laboratory media[J]. Journal of Applied Microbiology, 1980, 48: 387-396.

[20] PAW D. Qualitative and quantitative characterization of spoilage bacteria from packed fish[J]. International Journal of Food Microbiology, 1995, 26(3): 319-333.

[21] 李学英, 许钟, 杨宪时, 等. 大黄鱼腐败菌腐败能力分析与特定腐败菌鉴别[J]. 上海海洋大学学报, 2010, 19(4): 547-552.

Isolation, Identif i cation and Spoilage Capability of Dominant Spoilage Bacteria in Chilled Pork

HUANG Lin1,2，CHEN Quan-sheng1，ZHANG Yan-hua1，BI Xia-kun1，XU Hui1，ZHAO Jie-wen1,*
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. College of Biological Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In order to study the spoilage mechanism of chilled meat, dominant spoilage bacteria in chilled pork were isolated using selective medium and sensory evaluation and identified and their spoilage capability was measured by inoculating each identif i ed strain to sterilized pork, determining total volatile basic nitrogen (TVB-N) value and bacterial population during storage at 4 ℃ and calculating TVB-N production factor (YTVB-N). Five strains of dominant spoilage bacteria, designated as P3, PS1, J4, P5 and S5, were obtained and identified as Acinetobacter guillouiae, Pseudomonas koreensis, Bacillus fusiformis, Enterobacter cloacae and Brochothrix thermosphacta, respectively. After 7 days of storage at 4 ℃, pork inoculated with each of them spoiled visibly. Strain PS1 provided signif i cantly higher levels of TVB-N and YTVB-Nthan other spoilage bacteria. This indicates that Pseudomonas koreensis has potent spoilage capability in chilled pork.

chilled pork；dominant spoilage bacteria；isolation；identif i cation；spoilage capability

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0205-05

2011-10-19

江苏省自然科学基金项目(BK2009216)；江苏省普通高校研究生科研创新计划项目 (CXLX11_0603)

黄林(1977ü)，男，讲师，博士研究生，研究方向为农产品特性及其品质无损检测。E-mail：huanglin213@126.com

*通信作者：赵杰文(1945ü)，男，教授，博士，研究方向为农产品、 食品无损检测及其融合技术。E-mail：zhao_jiewen@ujs.edu.cn