大孔吸附树脂纯化黄芩中三种黄酮的含量测定

于艳，徐晶，修丽丽，田原

(1.辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032；2.辽宁中医药大学，沈阳 110032)

大孔吸附树脂纯化黄芩中三种黄酮的含量测定

于艳1，徐晶2*，修丽丽2，田原1

(1.辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032；2.辽宁中医药大学，沈阳 110032)

目的 建立高效液相色谱法同时测定大孔吸附树脂富集纯化后的黄芩提取物中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量的方法。方法 以AB-8型大孔吸附树脂对黄芩水提取物中总黄酮进行富集纯化，采用高效液相色谱法同时测定其中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量。色谱柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱；检测波长：280 nm；流速1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃。结果 黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素分别在0.022 4～0.448 0 μg (r=0.999 9)，0.021 0～0.420 0 μg(r=0.999 9)，0.010 3～0.205 0 μg(r=0.999 9)内线性关系良好；平均回收率分别为97.3%(RSD 1.71%)，98.4%(RSD 2.05%)，98.1%(RSD 1.65%)。黄芩水提取物经大孔吸附树脂纯化后，黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的平均含量分别为27.52%、6.87%和2.13%，未经纯化的黄芩水提取物中三者的平均含量分别为9.16%、1.66%和0.54%。结论 本方法简便、准确、灵敏度高，重复性好。

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，为临床常用中药，其性味苦、寒，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎之功效，用于湿温、暑湿、胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高热烦渴、血热吐衄、痈肿疮毒、胎动不安[1]。黄芩有效成分黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗变态、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等广泛药理作用[2-3]。

近年来，大孔吸附树脂在天然产物活性成分分离方面的应用日益广泛，具有分离纯化效果优良，可反复再生使用和低成本的应用特点[4-5]。本实验在前期的研究基础上，以AB-8型大孔吸附树脂对黄芩水提取物中总黄酮进行富集纯化，采用高效液相色谱法同时测定其中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，G1379A真空脱气机，G1311A四元梯度泵，G1313A自动进样器，G1315柱恒温箱，G1315B二极管阵列检测器；Agilent B 04 03色谱工作站；AE-240 电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；KH-400DB型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

1.2 试药

黄芩苷(批号：110715-200815)、黄芩素(批号：111595-200604)和汉黄芩素(批号：111514-200403)对照品均购自中国药品生物制品检定所，纯度均为98%以上。黄芩药材购自河北安国，经辽宁中医药大学鉴定教研室翟延君教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相：乙腈为流动相A，0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，0～15 min，A 24%；15～22 min，A 24%→39%；22～24 min，A 39%→44%，24 min后保持A 44%。检测波长：280 nm。流速：1.0 mL· min-1。柱温：30 ℃。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取黄芩苷对照品、黄芩素对照品和汉黄芩素对照品适量，置同一量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含黄芩苷22.4 µg、黄芩素21.0 µg和汉黄芩素10.3 µg的混合对照品溶液。

2.3 黄芩水提取液的制备[6]

取黄芩药材，加水煎煮3次，每次加水8倍量，每次煎煮40 min，滤过，合并3次煎液，即得黄芩水提取液。

2.4 供试样品的制备

2.4.1 未纯化供试品的制备 取“2.3”项下的水提取液，浓缩，水浴蒸干，置烘箱中70 ℃干燥至恒重，粉碎，即得。

2.4.2 纯化供试品的制备[7]取“2.3”项下的水提取液，经70 ℃水浴加热后量取一定体积(6倍树脂体积)，加入3%氯化钠溶解后加于预先处理好的AB-8型大孔吸附树脂上，待吸附完全后，用蒸馏水冲洗至近无色，用80%乙醇(8倍树脂体积)洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，水浴蒸干，置烘箱中70 ℃干燥至恒重，粉碎，即得。

2.5 供试品溶液的制备

取纯化供试品约0.05 g(未纯化供试品约0.4 g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.6 色谱图

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 µL，注入高效液相色谱仪，测定，即得，结果见图1。

图1 黄芩HPLC色谱图A-混合对照品；B-未纯化供试品；C-纯化供试品；1-黄芩苷；2-黄芩素；3-汉黄芩素Fig 1 HPLC chromatograms of Scutellaria baicalensis A-mixed reference substance; B-sample without purification; C-purified sample; 1-baicalin; 2-baicalein; 3-wogonin

2.7 线性范围考察

分别精密吸取混合对照品溶液1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱峰面积，进样量X(µg)与色谱峰面积Y经线性回归，得回归方程为：黄芩苷Y=3 635.3X-0.584 1，r=0.999 9；黄芩素Y=6 100X-4.016 5，r=0.999 9；汉黄芩素Y=6 307.4X-2.554 4，r=0.999 9。黄芩苷在0.022 4～0.448 0 μg，黄芩素在0.021 0～0.420 0 μg，汉黄芩素在0.010 3～0.205 0 μg内线性关系良好。

2.8 仪器精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，结果峰面积值的RSD分别为黄芩苷0.29%、黄芩素0.24%、汉黄芩素0.34%，表明仪器精密度较好。

2.9 重复性试验

取纯化供试品细粉6份，分别制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的平均含量分别为26.81%，6.31%，2.05%，RSD分别为0.76%、0.48%、0.64%，表明本方法重复性良好。

2.10 稳定性试验

取同一纯化供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10 h测定峰面积，结果含量的RSD分别为黄芩苷0.32%、黄芩素0.51%、汉黄芩素1.34%，表明本品溶液10 h内稳定性良好。

2.11 加样回收率试验

精密称取已知含量的纯化供试品0.025 g，共计6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照品溶液(含黄芩苷1.30 mg·mL-1，黄芩素0.30 mg·mL-1，汉黄芩素0.100 4 mg·mL-1)5.0 mL，蒸干溶剂，按“2.5”项下方法制备，进行含量测定，计算回收率，结果黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素平均回收率分别为97.3%、98.4%和98.1%，RSD分别为1.71%、2.05%和1.65%。结果见表1。

2.12 样品含量测定

取样品，按“2.5”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，用外标法计算样品中3种黄酮的含量，结果见表2。

3 讨论

在供试品溶液的制备过程中，本实验对提取溶剂、提取方法和提取时间进行了考察，分别选用50%甲醇、甲醇和乙醇为提取溶剂，考察了超声提取、加热回流提取二种方法，并考察了超声提取20，30，40 min黄芩苷等成分的提取率，结果以本实验所述方法为最佳提取方法。

表1 回收率试验结果Tab 1 The results of recovery test

表2 样品中黄芩苷、黄芩素与汉黄芩素的含量测定结果(n=3，±s )Tab 2 Determination results of baicalin, baicalein and wogonin(n=3,±s )

表2 样品中黄芩苷、黄芩素与汉黄芩素的含量测定结果(n=3，±s )Tab 2 Determination results of baicalin, baicalein and wogonin(n=3,±s )

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本实验考察了黄芩经大孔吸附树脂纯化供试品与未纯化供试品的出膏率和3种黄酮的含量，结果未纯化供试品的平均出膏率为48.51%，3种黄酮总含量为11.36%，纯化供试品的平均出膏率为14.46%，3种黄酮总含量为36.52%。以上结果表明，大孔吸附树脂可除去黄芩水提物中的大量杂质，使出膏率大大降低，并可较好地富集黄芩药材中的总黄酮类成分。

REFERENCES

[1] Ch.P(2010)VolⅠ(中国药典2010年版.一部)[S]. 2010: 282.

[2] WANG C M, LIU G, FEI Y, et al. Study on purifying technology for total flavonoids in Scutellaria baicalensis by macroporous absorption resin [J]. Chin Tradit Herb Drugs(中草药), 2010, 41(1): 58-60.

[3] HOU X Z, ZHANG Z Q, YOU C X, et al. Determination of six constituents in Scutellaria baicalensis Georgi by HPLC [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2012, 29(11): 1010-1014.

[4] YUAN G J, LONG L N. Separation of rosmarinic acid from Rosmarinus officinalis L. with macroporous absorption resin [J]. Lishizhen Med Mater Med Res(时珍国医国药), 2010, 21(1): 234-236.

[5] ZHANG X R, CUI B J, GUO W R. Study on extraction of active constituents of Yandeng dripping pills with macroporous adsorption resin [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2011, 28(5): 440-442.

[6] XU J, CHEN Z X, YUAN C L. Optimization of extracting method for Scutellaria baicalensis in Xiexin dropping pills by orthogonal test [J]. Liaoning J Tradit Chin Med(辽宁中医杂志), 2006, 33(6): 731.

[7] XU J, CHEN Z X, YUAN C L. Study on separation and purification of total flavonoids from Scutellaria baicalensis by the method of macroporous adsorption resin [J]. Chin Arch Tradit Chin Med(中医药学刊), 2006, 24(9): 1648-1649.

Determination of Three Kinds of Flavonoids in Scutellaria Baicalensis Purified by Macroporous Absorption Resin

YU Yan1, XU Jing2*, XIU Lili2, TIAN Yuan1
(1.The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning 110032, China; 2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning 110032, China)

OBJECTIVE To establish a method for determination of the content of baicalin, baicalein and wogonin in Scutellaria baicalensis purified by macroporous absorption resin by HPLC. METHODS The macroporous absorption resin AB-8 was used to separate and purify the total flavonoids in the water extract from Scutellaria baicalensis. The HPLC method was used to determine the content of baicalin, baicalein and wogonin. The analytical column was Agilent TC-C18(4.6 mm× 250 mm, 5 μm). The mobile phase was a mixture liquid of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid in water by gradient elution. The UV detector wavelength was 280 nm, the flow rate was 1.0 mL·min-1, and the column temperature was 30 ℃. RESULTS The linear ranges of baicalin, baicalein and wogonin were 0.022 4-0.448 0 μg(r=0.999 9), 0.021 0-0.420 0 μg(r=0.999 9), 0.010 3-0.205 0 μg(r=0.999 9), respectively. The average recoveries of the method for baicalin, baicalein and wogonin were 97.3% with RSD 1.71%, 98.4% with RSD 2.05% and 98.1% with RSD 1.65%, respectively. The average contents of baicalin, baicalein and wogonin in the water extract from Scutellaria baicalensis with macroporous absorption resin were 27.52%, 6.87% and 2.13%, and the average contents were 9.16%, 1.66% and 0.54% without purification. CONCLUSION The method is simple, accurate, sensitive and stable.

HPLC; macroporous absorption resin; baicalin; baicalein; wogonin

R284.2；R917.101

B

1007-7693(2013)10-1107-04

2012-08-06

辽宁省教育厅重点实验室项目(LS2010105)

于艳，女，博士生，主管中药师 Tel: 18909816763 E-mail: yuyangirl@yahoo.com.cn*

徐晶，女，硕士，教授 Tel: (024)86291931 E-mail: 95142012@qq.com

关键词：高效液相色谱；大孔吸附树脂；黄芩苷；黄芩素；汉黄芩素