疏乳消块方不同溶媒提取物对大鼠乳腺增生的治疗作用

段好刚，魏玉辉，李波霞，秦红岩，武新安

(兰州大学第一医院药剂科，兰州 730000)

疏乳消块方不同溶媒提取物对大鼠乳腺增生的治疗作用

段好刚，魏玉辉，李波霞，秦红岩，武新安*

(兰州大学第一医院药剂科，兰州 730000)

目的 观察疏乳消块方的水、50%乙醇，95%乙醇提取物对大鼠乳腺增生的治疗作用，确定提取物药效。方法 制备乳腺增生模型大鼠，分别灌胃给予疏乳消块方水、50%乙醇，95%乙醇提取物，采用照相显微镜观察乳腺组织病理变化，并观察乳头的形态学变化。结果 水提物低、中、高剂量对乳腺增生大鼠均有明显治疗作用，50%醇提物高剂量有治疗作用，95%醇提物低、中、高剂量治疗作用均不明显。结论 疏乳消块方的主要药效提取物为水提物。

疏乳消块方；乳腺增生；药效提取物

疏乳消块方由柴胡、当归、香附、元胡、皂刺、鳖甲、山慈菇、茯苓、白术、郁金、肉苁蓉、淫羊藿十二味中药组成，具有疏肝解郁、软坚散结之功效，用于治疗乳腺增生、乳痛等症[1]。该制剂是兰州大学第一医院协定处方(甘药制字Z04000808)，临床应用40多年已取得了较好的临床疗效。在前期研究中[2]，明确了疏乳消块丸对大鼠乳腺增生的治疗作用，并探讨了其作用机制。但该制剂制备工艺是处方药材粉碎后，以蜂蜜炼制成为大蜜丸，剂型较落后，患者服用不便。为进一步开发该制剂，本研究考察了疏乳消块处方不同溶媒提取物对乳腺增生大鼠的治疗效果，初步确定疏乳消块处方主要药效提取物，为疏乳消块方的新剂型研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 动物

Wistar大鼠，SPF级，♀，未孕，体质量180～220 g，由兰州大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(甘)2009-0004。

1.2 药品与试剂

疏乳消块方不同溶媒提取物，由兰州大学第一医院药剂科提供。苯甲酸雌二醇注射液(上海通用药业，批号：090802，1 mL∶1 mg)；黄体酮注射液(浙江仙琚制药司，批号：080103，1 mL ∶20 mg)；乳癖消片(辽宁好护士药业，批号：100113，0.32 g·片-1)；甲醛为分析纯。

1.3 仪器

ARA520电子分析天平(美国Ohaus公司)；H2050R低温离心机(长沙湘仪离心仪器有限公司)；CM1950全自动石蜡切片机(德国，LEICA公司)；Olympus(BX-50)照相显微镜。

2 方法

2.1 疏乳消块丸处方不同溶媒提取物的制备

疏乳消块方不同溶媒提取物由兰州大学第一医院药剂科制备，按疏乳消块方组方，称取处方药材，分别加12倍量水、50%乙醇及95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，浓缩干燥后计算提取率，结果分别为24.9%，19.8%及17.2%。

2.2 乳腺增生病模型的制备

健康未孕大鼠，♀，体质量180～220 g，在实验条件下饲养一周后，肌肉注射给予苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg·kg-1，1次·d-1，连续给药25 d；再肌肉注射给予黄体酮注射液4 mg·kg-1，1次·d-1，连续给药5 d。观察大鼠乳头外观，测量乳头高度及直径，并随机抽取5只大鼠处死，取乳腺做病理切片，判断模型是否成功。

2.3 分组及给药

选取模型成功的大鼠按乳头高度及体质量随机分为11组，即模型组、乳癖消组(阳性对照)、水提物低、中、高剂量组、50%醇提物低、中、高剂量组、95%醇提物低、中、高剂量组，另取正常大鼠做正常组。根据提取率和疏乳消块丸人给药剂量，计算不同溶媒提取物大鼠的给药剂量。不同溶媒提物低剂量组以人用剂量计算大鼠等效剂量，中剂量、高剂量分别以2倍量递增。低、中、高剂量组分别按生药0.86，1.72，3.44 g·kg-1·d-1，每日分2次灌胃；正常组与模型组灌胃给予相同体积的生理盐水，2次·d-1，连续30 d。乳癖消组灌胃给予乳癖消片1.0 g·kg-1·d-1，2次·d-1，连续30 d。

2.4 指标测定

2.4.1 大鼠乳房外观的变化 给药结束后，观察乳头颜色以及乳晕大小、颜色，用游标卡尺精确测量各组大鼠左右两侧第2对乳头直径及高度。

2.4.2 乳腺组织病理学观察 给药结束后，处死大鼠，摘取右侧第2对乳头，甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，制做病理切片，观察乳腺组织病理变化。病理组织学观察指标：病理组织学专家结合文献报道[3]，制定大鼠乳腺增生病变的诊断和分级标准。诊断标准：乳腺组织中小叶数量增多，体积增大；小叶内腺泡扩大，管腔内有分泌物；腺上皮细胞肥大，胞浆透亮；各级导管增生延长、扩张，甚至呈囊性，腔内有数量不等的分泌物；导管上皮增生呈乳头状和(或)细胞核浓染、异型和(或)大汗腺样化生。具体乳腺增生病变分级标准见表1。

2.4.3 体质量及脏器指数变化 各组大鼠给药30 d后处死，分别测定体质量、胸腺、脾脏和子宫重量，按以下公式计算脏器指数：脏器指数=脏器质量(g) /体质量(100 g)。

2.5 统计方法

采用SPSS 12.0统计软件对实验数据进行统计学处理，所有计数资料均以±s 表示，多组间均数比较采用方差分析；对乳腺的病理学检查结果采用等级资料的秩和检验。

3 结果

3.1 各组大鼠乳头外观及高度变化

正常组大鼠隔毛看不见乳头位置，将毛分开后可见大鼠乳头呈小米粒样，紧贴在皮肤上，较柔软，不见乳晕，整个乳房呈白色。模型组大鼠乳头竖起、较坚实、充血、增高、隆起，有乳晕，呈深紫红色，隔毛可见。乳癖消组多数大鼠乳头竖起，增高，有乳晕，呈浅红色，个别大鼠乳头接近正常大鼠；与正常组相比，模型组大鼠的乳房直径和乳头高度显著增大(P＜0.05)；与模型组大鼠相比，水提物各组大鼠乳房直径、乳头高度明显减小(P＜0.05或P＜0.01)；50%醇提物3.44 g·kg-1·d-1组大鼠乳房直径、乳头高度，有显著差异(P＜0.05)，而50%醇提物0.86 g·kg-1·d-1及1.72 g·kg-1·d-1组无统计学差异；95%醇提物各剂量组大鼠与模型组相比均无统计学差异。各组大鼠乳房直径及乳头高度测量结果见表2。

表2 不同溶媒提取物对乳腺增生大鼠乳头直径及高度的影响(n=10，±s )Tab 2 Effect of different extract on the teats height and diameter in hyperplasia of mammary gland rats(n=10,±s )

表2 不同溶媒提取物对乳腺增生大鼠乳头直径及高度的影响(n=10，±s )Tab 2 Effect of different extract on the teats height and diameter in hyperplasia of mammary gland rats(n=10,±s )

注：与模型组相比，1)P＜0.05，2)P＜0.01；与正常组相比，3)P＜0.05Note: Compared with model group,1)P＜0.05,2)P＜0.01; compared with normal group,3)P＜0.05

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3.2 各组大鼠乳腺病理组织学改变比较

正常组大鼠乳腺组织无增生现象，模型组大鼠乳腺组织中，腺泡扩张，数量增多，分泌现象明显，腺泡上皮出现增生，小叶内纤维组织明显增多。乳癖消片治疗后，乳腺腺泡数目减少，腺泡开始萎缩，导管管腔变小，增生情况得到改善；给药30 d后，水提物各剂量组大鼠乳腺增生程度明显改善，小叶数、平均腺泡数明显减少、腺泡直径及数量、腺腔内分泌物明显减少；且相对于乳癖消组腺泡分泌现象改善更明显。50%醇提物3.44 g·kg-1·d-1组大鼠乳腺增生程度减轻，小叶数、平均腺泡数明显减少；而50%醇提物0.86 g·kg-1·d-1及1.72 g·kg-1·d-1组大鼠乳腺增生程度只有个别大鼠乳腺增生程度减轻；95%醇提物各剂量组大鼠，乳腺增生程度出现个别减轻现象。乳腺组织病理改变显微观察图见图1。

对各组大鼠乳腺增生程度进行分级积分统计，结果显示模型组平均积分与正常组相比显著升高(P＜0.01)；乳癖消组、水提物0.86 g·kg-1·d-1及1.72 g·kg-1·d-1组与模型组相比，大鼠乳腺增生程度有所减轻，平均积分与模型对照组相比有统计学差异(P＜0.05)，而水提物3.44 g·kg-1·d-1组平均积分与模型组相比有显著性差异(P＜0.01)；50%醇提物0.86 g·kg-1·d-1及1.72 g·kg-1·d-1组平均积分均小于乳癖消组积分，但无统计学差异，而50%醇提物3.44 g·kg-1·d-1组平均积分与模型组相比有统计学差异(P＜0.05)；95%醇提物各剂量组与模型组相比均无统计学差异。各组大鼠乳腺增生程度分级积分表见表3。

表3 不同溶媒提取物对大鼠乳腺增生病理组织学评级的影响(n=10)Tab 3 Effect of different extract on pathological change of mammary gland in hyperplasia of mammary gland rats(n=10)

3.3 不同溶媒提取物乳腺增生大鼠对体重及脏器指数的影响

与正常组相比，模型组大鼠的体质量有所减小，胸腺指数明显减小(P＜0.05)，子宫指数显著增大(P＜0.05)；与模型组相比，水提物各剂量组体质量均有所增加，但无统计学差异，而胸腺指数均有显著性增加(P＜0.05)，子宫指数显著降低(P＜0.05)，脾脏指数均无显著差异；50%醇提物各剂量组及95%醇提物各剂量组大鼠胸腺指数、肾脏指数及子宫指数均无统计学差异，结果见表4。

4 讨论

乳腺增生病又称乳腺结构不良，以乳房疼痛和乳房肿块为特征，是女性常见、多发疾病，病变是以乳腺固有组织增生为主的非炎症性、非肿瘤性病变，主要包括乳痛症、乳腺病、乳腺纤维囊性增生[4]。近年来其癌变率有逐年升高的趋势。目前尚无特效治疗药，西医治疗多用激素治疗，能暂时缓解症状，但不良反应大，长期服用疗效不确切，局部手术切除却不易为患者接受，又易复发。近年来中医药治疗本病取得了长足的进展，具有临床疗效确切和不良反应小的优点，展示了良好的发展前景。许多研究表明[5-8]，中药复方制剂对乳腺增生病具有良好的治疗作用。

疏乳消块方由柴胡、当归、香附、郁金等中药组成，是兰州大学第一医院协定处方，临床应用40多年已取得了较好的临床治疗乳腺增生的效果。前期研究表明[2]，疏乳消块丸对大鼠乳腺增生有明显的治疗作用，其机制可能是通过调整体内激素水平，抑制胸腺指数降低，间接作用于乳房，从而起到治疗作用。为了对该处方进行新剂型开发，本实验考察了不同溶媒提取物对大鼠乳腺增生的治疗作用，确定了疏乳消块方的药效提取物。实验结果表明，水提物不同剂量组对大鼠乳腺增生有明显的治疗作用，能不同程度的抑制乳腺增生，减少乳腺小叶和腺泡数量，且能不同程度的影响脏器指数；50%醇提物高剂量对大鼠乳腺增生也有明显治疗作用，中、低剂量则无明显治疗作用；95%醇提物各剂量组治疗效果均不明显。因而疏乳消块方主要药效提取物为水提物，下一步将对该处方进行新剂型研究。

表4 不同溶媒提取物对乳腺增生大鼠脏器指数的影响(n=10，±s )Tab 4 Effect of different extract on the indexes of organs in hyperplasia of mammary gland rats (n=10,x±s )

表4 不同溶媒提取物对乳腺增生大鼠脏器指数的影响(n=10，±s )Tab 4 Effect of different extract on the indexes of organs in hyperplasia of mammary gland rats (n=10,x±s )

注：与模型组相比，1)P＜0.05，2)P＜0.01；与正常组相比，3)P＜0.05Note: Compared with model group,1)P＜0.05,2)P＜0.01; compared with normal group,3)P＜0.05

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REFERENCES

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[2] DUAN H G, WEI Y H, LI B X, et al. Therapeutic effects and mechanism of Shuru Xiaokuai pill on hyperplasia of mammary glands in rats [J]. Chin Hosp Pharm J (中国医院药学杂志), 2012, 32(16): 1273-1276.

[3] ZHOU H, LONG Z J, CHEN M, et al. Influence of Kangruzeng tabet on mammary tissue of mammary gland hyperplasia models in rat [J]. Chin Tradit Pat Med (中成药), 2008, 30(10):1536-1538.

[4] ZUO W S. Contemporary Oncology of the Breast (现代乳腺肿瘤学) [M]. 2ed Ed. Ji’nan: Shandong Science and Technology Press, 2006: 2382-2389.

[5] LI W M, XIE M Q, LI W H, et al. Therapeutic effect of Rupishu decoction on cyclomastopathy in rats [J]. J Beijing Univ TCM (北京中医药大学学报), 2009, 32(3): 188-190.

[6] CHEN S S, GUO Q S, JIN R, et al. Effects of Rukuaixiao decoction on hyperplasia of mammary gland in rats [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2007, 32(12): 1198-1202.

[7] LIU X M, LI G. Effects of Ruzengxiao on rats with hyperplasia of mammary glands [J]. J Chin Pharm (中国药房), 2007, 18(30): 2342-2344.

[8] ZHANG X S, YANG R, WU M, et al. Experimental study of Sanxiangruzengxiao capsule on hyperplasia of mammary glands [J]. Mod J Integr Tradit Chin West Med(现代中西医结合杂志), 2011, 20(23): 2880-2881.

Therapeutic Effect of Different Extract of Shuru Xiaokuai Decoction on Hyperplasia of Mammary Glands in Rats

DUAN Haogang, WEI Yuhui, LI Boxia, QIN Hongyan, WU Xin’an*
(Department of Pharmacy, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

OBJECTIVE To observe the therapeutic effect of different extract (water, 50% ethanol and 95% ethanol) of Shuru Xiaokuai decoction on hyperplasia of mammary glands in rats, and to identify the extract with therapeutical effect. METHODS The model of hyperplasia of mammary glands was prepared in Wistar female rats. After oral administration of different extract (water, 50% ethanol and 95% ethanol) of Shuru Xiaokuai decoction, the pathologic changes of mammary gland were observed under microscope, and the morphologic changes of nipple in every group observed. RESULTS The aqueous extract at low, middle and high dosage had a significant therapeutic effect on hyperplasia of mammary gland in rats. Only extract of 50% ethanol at high dosage had therapeutic effect, and all of 95% ethanol extract had no therapeutic effect on hyperplasia of mammary gland in rats. CONCLUSION The active extract of Shuru Xiaokuai decoction on hyperplasia of mammary glands in rats were aqueous extract.

Shuru Xiaokuai decoction; hyperplasia of mammary glands; the active extract

R285.5

A

1007-7693(2013)10-1058-05

2013-01-09

甘肃省卫生厅重点中医药科研项目(GZK-2009-15)；兰州市科技计重大新药创制专项(2009-2-17)

段好刚，男，硕士，主管药师 Tel: (0931)8356567 E-mail: duanhg06@163.com*

武新安，男，博士，教授，博导 Tel: (0931)8356511 E-mail: xinanwu6511@163.com