喘息样支气管炎患儿肠道菌群变化与CD3+CD8-IL-17+细胞关系的研究

方 骞，梁庆红，郝明明，王 烨，张 琳

（河北医科大学第三医院儿科，河北石家庄050051）

·论 著·

喘息样支气管炎患儿肠道菌群变化与CD3+CD8-IL-17+细胞关系的研究

方 骞，梁庆红，郝明明，王 烨，张 琳*

（河北医科大学第三医院儿科，河北石家庄050051）

目的探讨肠道菌群变化、CD3+CD8-IL-17+细胞在喘息样支气管炎患儿发病机制中的作用关系。方法采用荧光定量聚合酶链式反应（flurogenic quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）、流式细胞技术和酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分别检测47例喘息样支气管炎患儿、40例急性支气管炎患儿、43例同期健康查体儿童粪便中双歧杆菌和大肠杆菌数量、外周血单个核细胞CD3+CD8-IL-17+浓度和血浆白细胞介素（interleukin-17，IL-17）水平。结果①喘息样支气管炎患儿和急性支气管炎患儿粪便中双歧杆菌数量、双歧杆菌/大肠杆菌（bifidobacteria/E.coli，B/E）值低于健康对照组（P＜0.05）；喘息样支气管炎患儿双歧杆菌数量、B/E值低于急性支气管炎患儿（P＜0.05）。②喘息样支气管炎、急性支气管炎患儿外周血CD3+CD8-IL-17+细胞百分数和血浆IL-17水平均高于健康对照组（P＜0.05）；喘息样支气管炎患儿外周血CD3+CD8-IL-17+细胞百分数高于急性支气管炎患儿（P＜0.05），血浆IL-17水平低于急性支气管炎患儿（P＜0.05）。③喘息样支气管炎和急性支气管炎患儿外周血CD3+CD8-IL-17+细胞百分数与血浆IL-17水平呈正相关。喘息样支气管炎患儿肠道B/E值与外周血CD3+CD8-IL-17+细胞百分数呈负相关。结论喘息样支气管炎患儿发病初期即发生肠道菌群紊乱，肠道微生物定植抗力降低，CD3+CD8-IL-17+细胞介导的炎症反应参与其病理机制。

支气管炎；双歧杆菌；大肠杆菌

近10年儿童哮喘发病率呈上升趋势，流行病学资料显示85％儿童哮喘在3岁前发病［1］，除了哮喘诊断率提高外，部分原因是对婴幼儿期喘息样支气管炎的诊治重视不够，减少婴幼儿期喘息反复发作，可降低儿童哮喘的发生风险。哮喘的病因和病理机制复杂，Th1/Th2失衡是其经典发病学说，近年来发现CD3+CD8-IL-17+细胞不仅参与自身免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病和急性冠状动脉综合征等疾病的发病，且在哮喘等过敏性疾病中发挥重要作用。肠道正常菌群对机体免疫的成熟和发育起到重要作用，并诱导口服免疫耐受。湿疹、食物过敏、过敏性皮炎和哮喘患儿肠道菌群结构发生改变，补充益生菌在防治过敏性疾病中起到积极作用。本研究通过观察喘息样支气管炎患儿肠道菌群变化、外周血单个核细胞CD3+CD8-IL-17+细胞百分数和血浆白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）水平，探讨肠道菌群结构与CD3+CD8-IL-17+细胞在其发病中的作用关系，为其发病机制提出新观点，并为益生菌早期应用预防喘息样支气管炎反复发作提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2011年10月—2012年3月在我院儿科住院的喘息急性发作并符合喘息样支气管炎诊断标准［2］的47例患儿为A组，其中男性22例，女性25例，年龄1.6～2.5岁，平均（2.10± 0.26）岁；选择同期入院符合急性支气管炎诊断标准［2］的40例患儿为B组，其中男性17例，女性23例，年龄1.5～2.8岁，平均（2.20±0.28）岁；选择同期在我院健康查体儿童43例为C组，其中男性21例，女性22例，年龄1.4～2.5岁，平均（2.1± 0.25）岁。纳入标准包括无心、肺、肝或肾疾患；近6个月无呼吸道和消化道感染史；无个人及家族过敏性疾患及其他变态反应性疾病史。排除标准包括入院前2周应用糖皮质激素、抗组胺药、免疫调节剂；原发或继发性免疫功能缺陷；活动性肺结核；先天性气道、肺实质发育异常；先天性心脏病；胃食管反流；有心、肝、肾疾病者；近2个月内发生腹泻或服用益生菌制剂者；入院前1周使用抗生素者。3组均为石家庄周边县市儿童，喂养方式为断乳后添加辅食，3组性别、年龄、体质量差异均无统计学意义。

1.2 方法：3组均于入院当日或次日清晨空腹下抽取外周静脉血2mL于肝素钠抗凝管中，1 500r/min离心10min，取上清液置-20℃冰箱保存备用。同时收集儿童4h内粪便置于无菌干燥瓶，-80℃冰箱保存备用。采用16SrRNA荧光定量PCR检测各组患儿肠道双歧杆菌、大肠杆菌数量，应用Corbett Research公司生产的Rotor-Gene荧光定量PCR仪；采用流式细胞术检测外周血单个核细胞CD3+CD8-IL-17+水平，流式细胞仪Epics XL由美国Beckman coulter公司生产；采用ELISA法检测血浆中IL-17的水平，人IL-17 ELISA定量检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。实验步骤按说明书进行。

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析。计量资料以±s表示，分别采用F检验和q检验；相关性采用Perason直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肠道菌群：A、B组粪便中双歧杆菌浓度、B/E值均低于C组（P＜0.05）；A组双歧杆菌浓度、B/E值低于B组（P＜0.05）。见表1。

2.2 外周血单个核细胞CD3+CD8-IL-17+细胞百分数和血浆IL-17水平：A、B组外周血CD3+CD8-IL-17+细胞百分数和血浆IL-17水平高于C组（P＜0.05）；A组外周血CD3+CD8-IL-17+细胞百分数高于B组，血浆IL-17水平低于B组（P＜0.05）。见表2。

2.3 相关性分析：A、B组外周血CD3+CD8-IL-17+百分数与血浆IL-17均呈正相关（r=0.377、0.329，P＜0.05）；A组肠道B/E值与CD3+CD8-IL-17+细胞百分数呈负相关（r=-0.349，P＜0.05）。

表1 3组肠道双歧杆菌、大肠杆菌菌群数量比较Table 1 Comparision of quantity of fecal m icroorganism s am ong three groups（±s）

表1 3组肠道双歧杆菌、大肠杆菌菌群数量比较Table 1 Comparision of quantity of fecal m icroorganism s am ong three groups（±s）

*P＜0.0 5 vs group C #P＜0.05 vs group B by q test

Groups n Bifidobacteria（copies/g）B/E A 47 5.22±0.55*#7.81±1.00 0.72±0.11*#E.coli（copies/g）B 40 5.99±0.64*7.87±0.86 0.81±0.24*C 43 8.94±0.85 7.60±1.01 1.17±0.21

表2 3组外周血单个核细胞CD3+CD8-IL-17+细胞百分数和血浆IL-17浓度比较Table 3 Percentage of CD3+CD8-IL-17+（Th17）cells and concentrations of the p lasma IL-17 in three groups（±s）

表2 3组外周血单个核细胞CD3+CD8-IL-17+细胞百分数和血浆IL-17浓度比较Table 3 Percentage of CD3+CD8-IL-17+（Th17）cells and concentrations of the p lasma IL-17 in three groups（±s）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group B by q test

Groups n CD3+CD8-IL-17+（％）IL-17（ng/L）A 47 0.36±0.10*170.16±37.32*#B 40 0.33±0.10*225.06±58.37*43 0.26±0.11 108.93±21.31 C

3 讨 论

世界范围内哮喘和过敏性疾病发病率普遍增高［3］。不同国家过敏性疾病患病率不同，而且过敏性疾病儿童与健康儿童间肠道菌群的构成也有所不同，主要表现在肠道原居菌和梭状芽孢杆菌数量的变化。我们立足于微生态学观点，探讨喘息样支气管炎患儿肠道菌群变化及与CD3+CD8-IL-17+细胞的作用关系，阐释肠道菌群与CD3+CD8-IL-17+细胞在儿童喘息发作中的作用机制。

人体肠道菌群是一个复杂的微生态系统，在抵御病原微生物的侵入（防御感染）、限制病原微生物生长、调节免疫应答和促进营养吸收等方面发挥重要作用。流行病学资料显示过敏儿童与健康儿童相比，肠道梭状芽胞杆菌数量增多而双歧杆菌数量减少［4］。本研究显示，喘息样支气管炎和急性支气管炎患儿肠道双歧杆菌数量和B/E值均低于健康儿童，而且喘息样支气管炎患儿在喘息急性发作时肠道双歧杆菌数量和B/E值低于急性支气管炎患儿。表明喘息发作处应激状态时机体存在低氧血症，肠道环境发生改变，加之受到病原微生物的侵袭，导致肠黏膜屏障功能受损，引发肠道菌群紊乱。

CD3+CD8-IL-17+细胞是近来发现的不同于Th1、Th2的另一种CD4+T细胞的新亚型，是重要的促炎症细胞，可通过分泌IL-17诱导多种前炎症因子和趋化因子。IL-17是T淋巴细胞诱导的炎症反应的早期启动因素［5］，是调节炎症反应的关键细胞因子，能诱导平滑肌细胞表达IL-6和IL-8，诱导支气管上皮细胞表达IL-8、粒细胞集落刺激因子、CXCLl等，并诱导支气管成纤维细胞表达IL-8、IL-6和CXCL1/Gro-α等，而IL-8和CXCLl是中性粒细胞趋化因子，IL-6和粒细胞集落刺激因子是中性粒细胞生成因子，促进粒细胞增殖，诱导和加重气道炎症反应。国内一项研究［6］显示，5岁以下喘息儿童有特应质高危因素组和无特应质高危因素组IL-17水平均较同期同龄对照组儿童增高。Xiong等［7］的一项动物实验研究证实，哮喘大鼠肺组织中Th17细胞分泌的IL-17A与支气管肺泡灌洗液中的嗜酸粒细胞及中性粒细胞增多明显正相关，因此IL-17A可能与哮喘中嗜酸粒细胞及中性粒细胞增多有关。本研究显示，喘息样支气管炎和急性支气管炎患儿外周血CD3+CD8-IL-17+细胞百分数和血浆IL-17水平较健康儿童升高。说明CD3+CD8-IL-17+细胞参与了气道的炎症，并激活T细胞的分化向CD3+CD8-IL-17+细胞倾斜，引起IL-17分泌增多，两者间存在直线正相关关系。

CD3+CD8-IL-17+细胞是促进炎症反应的辅助T细胞，许多细胞因子、免疫细胞、信号分子、Toll样受体等参与CD3+CD8-IL-17+细胞的分化。国外一项研究［8］发现，特定的肠道共生菌能够促进小肠黏膜固有层CD3+CD8-IL-17+细胞的分化，不依赖于Toll样受体、IL-21或IL-23信号途径，但需要转化生长因子β的活化作用。大量细菌微生物维持机体的免疫平衡状态，调节对病原微生物的免疫应答［3］。肠道菌群也可能通过作用于调节性T细胞起到间接调控CD3+CD8-IL-17+细胞的作用。本研究显示，喘息样支气管炎患儿肠道B/E值与外周血CD3+CD8-IL-17+细胞百分数呈直线负相关。说明喘息样支气管炎患儿肠道菌群的变化与外周血CD3+CD8-IL-17+细胞的百分数存在关系，菌群的紊乱通过影响肠道黏膜免疫系统或机体免疫应答影响CD3+CD8-IL-17+细胞的分化发育，而且CD3+CD8-IL-17+参与了发病初期的炎症反应，并加剧了肠道微生态环境的改变。

哮喘是一个复杂的免疫性疾病，众多的细胞因子和炎症介质参与发病过程，CD3+CD8-IL-17+细胞亚群的发现，弥补了Th1/Th2失衡机制的不足，但CD3+CD8-IL-17+和IL-17作用在哮喘发病的不同阶段，尤其在免疫细胞、分子网络中的相互调节作用及其与肠道菌群的具体作用机制还有待进一步揭示。喘息样支气管炎患儿肠道双歧杆菌数量减少、肠道微生物定植抗力降低，肠道菌群的紊乱影响机体的免疫反应，加剧炎症反应，所以在防治疾病的同时纠正肠道菌群失衡是必要的，这又为我们提出了一系列问题，摄入益生菌是否能预防哮喘和过敏性疾病，还需要大量的临床和实验室研究，以提供证据。在喘息样支气管炎发病早期积极控制炎性反应、改善喘息症状同时调节肠道菌群紊乱，不失为一种预防和治疗哮喘和过敏性疾病的新途径。

［1］ 陈育智.中国儿童哮喘防治近况［J］.中华儿科杂志，2004，42（2）：81.

［2］ 胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学［M］.7版.北京：人民卫生出版社，2002：1172-1177.

［3］ HANSEL TT，JOHNSTON SL，OPENSHAW PJ.Microbes and mucosal immune responses in asthma［J］.Lancet，2013，381（9369）：861-873.

［4］ OZDEMIR O.Various effects of different probiotic strains in allergic disorders：an update from laboratory and clinical data［J］. Clin Exp Immunol，2010，160（3）：295-304.

［5］ 赵银霞，许化溪.白细胞介素17细胞因子家族与支气管哮喘［J］.中华哮喘杂志，2010，4（3）：218-221.

［6］ 杨金玲，王秀芳.5岁以下喘息儿童血清白细胞介素-17表达的意义［J］.实用儿科临床杂志，2010，25（4）：266-268.

［7］ XIONGW，ZENG D，XU Y，et al.Expression of interleukin-17 in lung and peripheral blood of asthmatic rats and the influence of dexamethasone［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2007，27（5）：498-500.

［8］ IVANOV II，FRUTOSRDE L，MANELN，etal.Specificmicrobiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine［J］.Cell Host Microbe，2008，4（4）：337-349.

（本文编辑：刘斯静）

图2 成人型多囊肾（LK：左肾）

图3 孕妇双肾（LK：左肾；RK：右肾）

图4 胎儿单纯性肾回声增强（LK：左肾；RK：右肾）

讨 论在常规产前超声检查中，遇到胎儿肾脏回声增强应该考虑以下疾病：①婴儿型多囊肾，为常染色体隐性遗传。超声表现为双侧肾脏对称性、均匀性增大；孕晚期胎儿双侧肾脏显著增大，可达正常肾脏的3～10倍；双侧肾脏回声增强，以肾髓质为主；孕晚期羊水过少。例1即为典型病例。②成人型多囊肾，为常染色体显性遗传。超声表现为双侧肾脏增大，回声增强，但与婴儿型多囊肾相反的是，成人型多囊肾可较好地显示低回声的肾髓质，且肾髓质无明显增大；羊水量正常。父母一方有多囊肾超声表现是诊断胎儿成人型多囊肾的有力证据。例2是典型病例。③染色体异常胎儿肾脏表现。④巨细胞病毒感染是肾脏回声增强的另一个常见原因，但如果检出脑积水、脑室周围钙化灶、小头畸形时，则提示此种感染的可能性较大。⑤单纯性胎儿肾脏回声增强或肾脏发育不良。例3则是典型病例。

综上所述，当发现胎儿肾脏回声增强时应该重点观察肾脏的大小、回声增强部位以及羊水量的多少，尤其是动态观察，以期为临床处理提供必要的依据。另外，对单纯性胎儿肾脏回声增强也不能掉以轻心，在产后应加强随访，其中有些可能存在肾脏问题［1-2］。

【参考文献】

［1］ 李胜利.胎儿畸形产前超声诊断学［M］.北京：人民军医出版社，2006：269-271.

［2］ 严英榴，杨秀雄.产前超声诊断学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2012：394.

（本文编辑：赵丽洁）

STUDY OF RELATIONSHIP BETWEEN INTESTINAL NORMAL FLORA AND CD3+CD8-IL-17+IN CHILDREN W ITH ASTHMATOID BRONCHITIS

FANG Qian，LIANG Qinghong，HAO Mingming，WANG Ye，ZHANG Lin*
（Department of Pediatrics，the Third Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050051，China）

Objective To investigate the variations of intestinal flora and the relationship between intestinal flora and CD3+CD8-IL-17+cells in children with asthmatoid bronchitis.MethodsForty-seven children with asthmatoid bronchitis，forty chilidren with acute tracheitis and forty-three healthy children were selected in the corresponding time period.The bifidobacteria and E.coli DNA in fecal samples were detected by fluorogenic quantitative polymerase chain reaction.The percentage of CD3+CD8-IL-17+cells in peripheral blood mononuclear cellswere detected by flow cytometrie analysis. Interleukin-17（IL-17）in plasma was detected by enzyme linked immunosorbent assay.Results①The quantity of fecal bifidobacteria and bifidobacteria/E.coli（B/E）values in children with asthmatoid bronchitis and acute tracheitiswere lower than those in healthy children（P＜0.05）；The quantity of fecal bifidobacteria and B/E values in children with asthmatoid bronchitis were lower than those in childrenwith acute tracheitis（P＜0.05）.②The percentage of CD3+CD8-IL-17+cells and the IL-17 level in children with asthmatoid bronchitis and acute tracheitiswere higher than those in healthy children（P＜0.05）.The percentage of CD3+CD8-IL-17+cellswere higher in children with asthmatoid bronchitis，but the IL-17 level was lower than that in children with acute tracheitis（P＜0.05）.③There was a positive linear corelation between the percentage of CD3+CD8-IL-17+cells and the IL-17 level in children with asthmatic bronchitis and acute tracheitis.Therewas a negative linear corelation between B/E ratio and the percentage of CD3+CD8-IL-17+cells in children with asthmatic bronchitis.ConclusionThe construction of intestinal flora in children with asthmatoid bronchitis were disordered and intestinal microbial colonization resistance decreased；CD3+CD8-IL-17+cells in children with asthmatoid bronchitis are involved in the early period of disease and play an important role in the pathogenesis of asthmatoid bronchitis.

bronchitis；bifidobacteria；escherichia coli

R725.6

A

1007-3205（2013）08-0908-04

2013-03-18；

2013-04-15

河北省医学科学研究重点课题计划项目（20120103）

方骞（1986-），女，河南南阳人，河北医科大学第三医院医学硕士研究生，从事儿科疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：Lzhang79@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.08.014