注射用盐酸吉西他滨细菌内毒素检查方法的研究

郑 健，苏五缺，赵 珊，闫随朝*

（1.河北省石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司质量管理部，河北石家庄050000；

2.河北省制剂工程技术研究中心，河北石家庄050000）

·论 著·

注射用盐酸吉西他滨细菌内毒素检查方法的研究

郑 健1，2，苏五缺1，2，赵 珊1，2，闫随朝1，2*

（1.河北省石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司质量管理部，河北石家庄050000；

2.河北省制剂工程技术研究中心，河北石家庄050000）

目的 研究注射用盐酸吉西他滨对细菌内毒素检查实验的干扰情况，并建立其细菌内毒素检查的质量标准。方法参照中国药典细菌内毒素检查法进行实验，用2个不同厂家的鲎试剂对注射用盐酸吉西他滨进行干扰实验研究。结果通过调节样品pH进行干扰实验确证，按拟定标准检查，三批供试品的细菌内毒素检查结果均符合规定。结论可以用细菌内毒素检查法（凝胶法）代替家兔热原检查法控制其产品质量。

盐酸吉西他滨；内毒素类；方法

盐酸吉西他滨是细胞周期特异性抗代谢类药物，主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞，即S期细胞，在一定条件下，可以阻止G1期向S期的进展［1］；对非小细胞肺癌、胰腺癌呈现客观的疗效［2］。目前国内检查注射用盐酸吉西他滨热原的方法是家兔法［3］。由于家兔法存在生物学差异，设备要求高，加之注射用盐酸吉西他滨毒性较大［4］。细菌内毒素检查法可以克服以上缺点，且具有灵敏快速、简便易行、重现性好等优点。笔者采用凝胶法对注射用盐酸吉西他滨进行细菌内毒素检查，对用该方法代替家兔热原检查法的可行性进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 细菌内毒素限值L的确定：内毒素限值为L= K/M，式中K为按规定的给药途径，人体每公斤体质量每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5EU/（kg·h）；M为人体每公斤体质量每小时接受的最大给药剂量。一般我国人群平均体质量按60kg计算，平均体表面积按1.62m2计算［5］。注射用盐酸吉西他滨在单独或联

合用药时，推荐剂量为按体表面积内毒素限值为1 000～1 250mg/m2，静脉输注30min。

按联合用药计算M=1 250mg/（m2·h）×1.62m2/60kg=33.8mg/（kg·h）。最终内毒素限值L=5EU/（kg·h）/33.8mg/（kg.h）=0.15EU/mg。国家标准WS1-（X-429）-2003Z中，注射用盐酸吉西他滨内毒素的检查方法为热原法，按此方法，以国外产品为双对照，测定我公司仿制注射用盐酸吉西他滨内毒素限值为0.05EU/mg。

1.2 试剂：①注射用盐酸吉西他滨，石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司，规格0.2g/支（以吉西他滨计），批号20110301、20110302、20110303。②鲎试剂，湛江安度斯生物有限公司，规格0.1mL，批号1008262，灵敏度0.125EU/mL；湛江博康海洋生物有限公司，规格0.1mL，批号1003270，灵敏度0.125EU/mL；湛江安度斯生物有限公司，规格0.1mL，批号1006042，灵敏度0.06EU/mL。③细菌内毒素工作标准品，中国药品生物制品检定所，规格1mL，批号150601-201070，效价140EU/支。④细菌内毒素检查用水（BET水），湛江安度斯生物有限公司，规格100mL/瓶，批号1010120。⑤酸度调节剂，0.1mol/L氢氧化钠溶液，称取氢氧化钠（批号20100624，天津永大化学试剂有限公司，分析纯），用细菌内毒素检查用水在除热原的容器中配制成浓度为0.1mol/L的溶液。

1.3 实验仪器设备及用具：内毒素检测仪［（TAL-40D、能准确到（37±1）℃］、旋涡混合器（XW-80A）、电热鼓风干燥箱（WGL-45B、温度能达到250℃）、电子天平（型号AL204，感量0.1mg）、称量瓶、刻度吸管、微量移液器、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、剪刀、砂轮。

2 结 果

2.1 所用鲎试剂灵敏度复核

2.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备：用细菌内毒素检查用水将140EU/支细菌内毒素工作标准品复溶，制成0.25、0.125、0.06、0.03、0.015EU/mL等浓度的内毒素标准溶液。

2.1.2 待复核鲎试剂准备及加样反应：取0.1mL/支的鲎试剂1008262、1003270、1006042批各18支，加入0.1mL内毒素检查用水复溶，在已溶解的鲎试剂安瓿中分别加入2.0、1.0、0.5和0.25λ的内毒素溶液各0.1mL各4支，其余2支分别加入内毒素检查用水0.1mL，用封口膜封口，混匀，将其垂直放入内毒素检测仪中，保温（60±2）min。

2.1.3 结果观察：将鲎试剂管从内毒素检测仪中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180℃观察，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。1008262、1003270、1006042的灵敏度均在0.5～2.0λ范围内，均可用于干扰试验和供试品的内毒素检查。见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核结果Table 1 Sensitivity verification of TAL

2.2 干扰试验预实验

2.2.1 尝试剂选择：此实验选择λ=0.125EU/mL的鲎试剂（1008262批与1003270批）及λ= 0.06EU/mL的鲎试剂（1006042批）来进行实验。

2.2.1.1 最低有效浓度（minimum valid concentration，MVC）的计算：MVC=λ/L=0.125EU/ mL÷0.05EU/mg=2.5mg/mL。

2.2.1.2 细菌内毒素标准品制备：同2.1.1操作，用内毒素检查用水稀释成4.0、2.0λ（0.5、0.25 EU/mL）浓度的溶液，记作E0.5、E0.25。

2.2.1.3 样品制备：用内毒素检查用水将样品稀释成下列浓度的溶液（80、40、20、10、5、2.5mg/mL），记作S80、S40、S20、S10、S5、S2.5。

2.2.1.4 供试品阳性对照的制备：0.5mLE0.5+ 0.5mL S80-1.0mL S40E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S40-1.0mL S20E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S20-1.0mL S10E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S10-1.0mL S5E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S5-1.0mL S2.5E0.25。

2.2.1.5 加样反应：取鲎试剂复溶后，分别与2.2.1.3、2.2.1.4中溶液反应，同时做两管阳性对照，两管阴性对照。

2.2.1.6 结果：综合以上反应结果得出，采用不同灵敏度鲎试剂进行实验，均呈现明显的干扰抑制。见表2。

表2 供试品干扰试验预实验结果Table 2 Results of inhibition or enhancement pre-test for products

2.2.2 调节pH值进行干扰预实验：此实验选择λ=0.125EU/mL鲎试剂（1008262批）来进行实验。

2.2.2.1 细菌内毒素标准品制备：同2.1.1操作，用内毒素检查用水稀释成4.0、2.0λ（0.5、0.25EU/mL）浓度的溶液，记作E0.5、E0.25。

2.2.2.2 样品制备：用内毒素检查用水和0.1mol/L氢氧化钠溶液将样品20110301溶解并调节pH值为7.0得到20mg/mL溶液，再稀释成10、5、2.5mg/mL溶液，记作S20、S10、S5、S2.5。

2.2.2.3 供试品阳性对照的制备：0.1 mLE2.5+ 0.9mL S20-1.0mL S20E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S20-1.0mL S10E0.25，0.5 mLE0.5+0.5mL S10-1.0mL S5E0.25，0.5mLE0.5+0.5mL S5-1.0mL S2.5E0.25。

2.2.2.4 加样反应：取鲎试剂复溶后，分别与2.2.2.2、2.2.2.3中溶液反应，同时做2管阳性对照，2管阴性对照。

2.2.2.5 结果：调节pH值至7.0后，该样品在20mg/mL（S20）及以下浓度均无干扰。见表3。

表3 供试品干扰试验预实验结果Table 3 Results of inhibition or enhancement pre-test for products

2.3 干扰实验：根据干扰预实验结果可初步确定，选用灵敏度为0.125EU/mL的鲎试剂，以10mg/mL进行正式干扰实验。

2.3.1 细菌内毒素标准品制备：同2.1.1操作，用内毒素检查用水稀释成4.0、2.0、1.0、0.5、0.25λ（0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU/mL）浓度的溶液，记作E0.5、E0.25、E0.125、E0.06、E0.03。另取7EU/mL内毒素标准溶液1.0mL加入细菌内毒素检查用水1.8mL置旋涡。

混合器上混合30s，制成2.5EU/mL的内毒素标准溶液；取2.5EU/mL内毒素标准溶液1.0mL加入细菌内毒素检查用水1.0mL置旋涡混合器上混合30秒，制成1.25EU/mL的内毒素标准溶液；依次制成0.6、0.3EU/mL溶液，记作E2.5、E1.25、E0.6、E0.3。

2.3.2 样品制备：将3批样品用内毒素检查用水溶解后，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，再分别稀释成浓度为20mg/mL的溶液备用，记作S20，稀释步骤同2.2.2.2。

2.3.3 供试品的阳性对照的制备：0.5mL E0.5+ 0.5mL S20-1.0mL S10E0.25，0.5mL E0.25+0.5mL S20-1.0mL S10E0.125，0.5mL E0.125+0.5mL S20-1.0mL S10E0.06，0.5mL E0.06+0.5mL S20-1.0mL S10E0.03。

2.3.4 结果：采用2个厂家鲎试剂对3个批号注射用盐酸吉西他滨进行干扰试验，10mg/mL浓度下满足0.5Es≤Et≤2Es，说明供试品在10mg/mL及以下浓度无干扰，可采用灵敏度为0.125EU/mL的鲎试剂进行该产品的细菌内毒素检测。见表4。

表4 供试品干扰试验结果Table 4 Results of inhibition or enhancement test for products

2.4 注射用盐酸吉西他滨细菌内毒素检查：将3批供试品分别加入内毒素检查用水3mL溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，再用内毒素检查用水稀释成2.5mg/mL的溶液。用0.125EU/mL的鲎试剂，按2010版《中国药典（二部）》［5］及《中国药品检验标准操作规范》［6］，分别用2个厂家鲎试剂考察其内毒素限值，结果见表5。

表5 供试品细菌内毒素检测结果Table 5 Results of bacterial endotoxin test for products

以上实验结果表明，本品在10mg/mL及以下浓度下均无干扰，可采用细菌内毒素检查法，取本品，加入内毒素检查用水3mL使其溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，依法检查［5］，吉西他滨中含内毒素的量应小于0.05EU/mg。

3 讨 论

实验评价了注射用盐酸吉西他滨对鲎试剂与内毒素凝集反应是否有干扰作用，结果表明注射用盐酸吉西他滨用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值为中性后，按中国药典2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法实验，其20mg/mL及以下浓度对细菌内毒素检查无干扰作用，我们将供试品使用灵敏度λ为0.25EU/mL的鲎试剂进行细菌内毒素检查是可行的，确证了细菌内毒素法完全可以代替传统的家兔法进行注射用盐酸吉西他滨的热原检查。

注射用盐酸吉西他滨的细菌内毒素检查标准制定参考，取本品1支，加入内毒素检查用水3mL使其溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，依法检查（中国药典2010年版二部附录ⅪE）［5］，吉西他滨中含内毒素的量小于0.05EU/mg。

［1］ 赵可新，胡建平，单靖珊，等.盐酸吉西他滨临床应用进展［J］.中国医药导报，2006，3（36）：13-15.

［2］ 徐蕾，白中红，许软成.盐酸吉西他滨加顺铂化疗与三维适形放疗同步治疗局部中晚期非小细胞肺癌41例［J］.中国药业，2010，19（15）：64-65.

［3］ 王明乐，刘俊芳.细菌内毒素检测法与家兔法同步检测磷酸川芎嗪注射液热原的比较［J］.医学信息，下旬刊，2010，23（2）：265.

［4］ 彭玲聪，陈洁琼，瞿杨，等.注射用吉西他滨治疗肺癌的不良反应观察及对策［J］.海峡药学，2011，23（7）：217-218.

［5］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）［M］.2010版.北京：中国医药科技出版社，2010：99-101.

［6］ 中国药品生物制品检室所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范［M］.2010版.北京：中国医药科技出版社，2010：310-325.

（本文编辑：赵丽洁）

DETERM INATION OF GEMCITABINE HYDROCHLORIDE FOR INJECTION BYBACTERIAL ENDOTOXIN TEST

ZHENG Jian1，2，SUWuque1，2，ZHAO Shan1，2，YAN Suichao1，2*（1.Department of Quality Management，Hebei CSPC Zhongqi Pharmaceutical Technology（SJZ）Co.Ltd，Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China；2.Hebei Province Pharmaceutical Engineering Technology Research Center，Hebei Provinice，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo create a quality standard of gemcitabine hydrochloride for injection by determination of bacterial endotoxin.MethodsReferring to the demands of testing methods which are recorded in Chinese Pharmacopoei（avolume 2010）.Gemcitabine hydrochloride for injection was examined by using two different brands of Tachypleus Amebocyte Lysate（TAL）.ResultsThe results of bacterial endotoxin test of three lots were all complied with the quality control of gemcitabine hydrochloride for injection.ConclusionThemethod of bacterial endotoxin test is accurate and reliable，and it can replace the rabbit pyrogen test.

gemcitabine hydrochloride；endotoxins；methods

R927.1

A

1007-3205（2013）07-0792-04

2012-08-06；

2012-11-21

科技部“十一五”重大新药创制（2011ZX09401-306）

郑健（1972-），女，河北石家庄人，河北省石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司医药工程师，医学学士，从事药物生产研发实验室管理研究。

*通讯作者。E-mail：yanyuhanm@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.07.018