提高淋巴结病理切片质量的体会

宋 容，肖 觉

（重庆市肿瘤研究所病理科 400030）

淋巴结切片常规HE染色的制片方法一直是病理技术的难题［1］，其原因除淋巴结病变本身的复杂性外，主要还是由于切片质量较差所致。质量差的淋巴结切片比其他组织更容易造成假象而导致误诊。淋巴结病理诊断误诊率高达10%～30%，其中切片因素占多数［2］。淋巴结切片的制片必须遵循“薄切、淡染”的原则。按常规方法难以制作出优质淋巴结切片，为了克服淋巴结制片时经常出现裂痕、皱褶、破碎，染色过深或过浅等问题。作者经过多年的临床实践，总结出了一些优质淋巴结切片的制片经验和体会，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本院2011年1月至2012年12月淋巴结活检标本50例。

1.2 试剂 改进的B-5固定液［3］［（1）1%鞣酸1mL；（2）95%乙醇加8g水杨酸80mL；（3）甲醛15mL，3种液体混合配制成100mL后，取B-5液66mL加入甲醇480mL和氯仿240 mL混合，再加入醋酸80mL］。苏木精（hematoxylin）染色液、伊红（eosin）染色液、乙醇、硬脂酸、石蜡、0.5%～1.0%盐酸乙醇、二甲苯。

1.3 方法

1.3.1 固定 改进前常规淋巴结组织标本采用10%甲醛固定液，改进后淋巴结标本采用改进的B-5固定液。

1.3.2 取材 淋巴结取材大小1.0cm×1.0cm×0.3cm，取材要规范，取材刀要锋利，避免组织挤压，发生严重变性。

1.3.3 脱水 选用乙醇脱水效果最佳，从低浓度到高浓度乙醇脱水，脱水要彻底，脱水时间要严格控制。

1.3.4 透明及浸蜡 改进前用二甲苯透明剂石蜡浸蜡，改进后用硬脂酸和石蜡的混合液替代二甲苯透明剂。

1.3.5 包埋切片 硬蜡包埋，切片厚度2.5～3.0μm为宜，裱片，展片，烤片。

1.3.6 染色 苏木精染液染色时间短，流水冲洗，0.5%～1.0%盐酸乙醇分化，热水返蓝，伊红染色数秒，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2 结 果

对50例淋巴结活检标本HE切片的制片技术进行改进，获得了良好效果。与旧方法相比，采用该方法制作淋巴结切片，组织结构形态更完整，切片无皱褶，无刀痕，厚薄均匀，组织无挤压。镜下折光率强、胞质胞核着色分明，淋巴结结构清晰，皮质、髓质充分展现，淋巴滤泡清晰，色彩艳丽，均匀一致，核膜及核仁结构清楚［4］，核桨对比鲜明。制片优良率达到95%以上（图1、2）。

图1 改进前的淋巴结切片（HE×200）

图2 改进后的淋巴结切片（HE×200）

3 讨 论

淋巴结组织结构致密，细胞丰富，间质少，外周又有一层致密的纤维结缔被膜［5］。按常规病理制片技术操作过程，如标本取材、固定、脱水、透明和浸蜡到切片、染色等方法很难制作优质的淋巴结切片。应用改进后方法制作淋巴结HE切片，组织结构更清晰，色彩和对比度都优于常规切片，给病理诊断提供了可靠的保证，但是在制作淋巴结HE切片时必须注意以下环节。

3.1 避免组织损伤 组织损伤包括人为损伤、组织变干，组织损伤可由多个环节造成。人为损伤是由于病理技术人员在整个制片过程中操作不细心，造成切片划痕等；组织变干是由于组织没有及时固定或组织没有完全浸泡在固定液中，致使组织发生干缩变硬。标本及时充分地固定是制作良好组织切片的基础。标本离体后，无论大小均应立即固定，这是切片成功的关键。若组织固定不良，在以后的标本制备过程中则无法加以纠正，标本的固定液有几种，临床常用10%甲醛固定液和4%中性甲醛固定液，此种固定液配制方法简单，为大多数病理科采用，但是用于短时间内很难渗透到淋巴组织内部，组织边缘固定尚可，深部组织很难渗透进去，造成组织标本固定不均匀。采用加温固定，可使蛋白质凝固，但会造成组织自溶。使用改进的B-5固定液固定淋巴结，其渗透力强，能迅速渗入组织内部，能凝固组织细胞内成分，使组织达到一定硬度，从而获得较佳的折光率［6］。且其对染料具有较强的亲和力，无色素沉着，染色前无需进行脱色素处理。同时又不会使组织过度收缩或膨胀，短时间即可达到固定作用，并且能支持免疫组织化学、原位杂交和特殊染色技术［7］，是淋巴结的理想的固定液。将活检新鲜淋巴组织标本剖开，立即放入改进的B-5固定液培养瓶内。固定液的量是组织块总体积的4～5倍［8］，固定时间3h左右，保证细胞不发生自溶和降解。

3.2 取材规范 取材要规范，淋巴结取材时，采用锋利的刀、剪，刀刃宜薄，首先仔细剔除淋巴组织周围的脂肪组织，切取组织刀要从刀根向后拉动切开组织，动作应轻柔不能用力挤压组织，一刀切下避免重复，防止造成淋巴结中央凹陷或不完整，避免使用有齿镊子。这是淋巴结取材中需特别注意的问题，标本大小以1.0cm×1.0cm×0.3cm为宜。若过厚固定不好，组织结构不佳，过薄切片张数有限，如用于读片会的切片则难以满足需要；组织脱水，用新鲜脱水剂，室温下进行。加热脱水易造成组织变硬和细胞收缩，脱水剂采用低浓度至高浓度乙醇脱水，脱水时可增加脱水梯度，以利于在高浓度乙醇和无水乙醇中将组织残余水分除尽。脱水剂采用乙醇为佳，能置换组织中的水分，在淋巴结脱水与透明时，一般将固定好的组织块，放入80%乙醇60min，95%乙醇Ⅰ60min，95%乙醇Ⅱ60min，无水乙醇Ⅰ30min，无水乙醇Ⅱ30min。严格掌握脱水时间，如脱水时间过短，影响下一步透明，脱水时间长，组织收缩变硬，难以切出理想切片。组织透明及浸蜡，常规的组织透明采用二甲苯，二甲苯使用不当很容易造成组织收缩、变脆和硬化，淋巴结组织更是如此。采用硬脂酸和石蜡的混合替代二甲苯进行处理，作为脱水剂和石蜡间的中介剂，因硬脂酸对组织具有软化兼透明的作用，使用硬脂酸处理标本后，组织质地柔韧，这样可以有效避免组织收缩、变脆和硬化，即使纤维成分较多的组织，也容易切出薄而完整的切片。具体方法是：组织经过无水乙醇浸毕后，用硬脂酸和石蜡的混合液替代二甲苯进行透明剂处理。直接浸入硬脂酸和石蜡混合液Ⅰ，其配制比例为3∶2，浸入时间1h，温度56～58℃。然后浸入硬脂酸和石蜡混合液Ⅱ，其配制比例为2∶3，浸入时间1h，温度56～58℃，注意石蜡要定期更换。包埋的要点是：先将熔化的石蜡倒入包埋框，用加温的镊子轻轻夹住组织块放入包埋框内，用镊子轻轻压平组织块，使组织块平整放置，避免因镊子用力挤压而造成的人为破坏。包埋用蜡的熔点56～58℃为宜。将包埋后蜡块稍凝固，再移入冷台冷却后，按报道更利于薄切［9］。

3.3 切片制作完整 切片制作要完整，切片刀要非常锋利，最好使用一次性刀片，切片厚度2.5～3.0μm。修整蜡块时，先粗约将蜡块组织修平成最大面后，然后移动刀刃用不同的区段切片。切片刀刃必须保持完好和清洁，操作时用力轻柔适当，转速均匀，避免切削时切片刀对蜡块形成挤压，导致组织切片比蜡块显著缩小，组织压缩，细胞变形。切片刀钝、角度太大或切片速度太快，致使切片不是被切出来的而是被刮下来的。切片动作太猛会造成搓衣板样改变；漂烘仪的水温控制在40～45℃为宜，水温太高，造成组织切片扩散，形成人为裂隙，造成假象，容易误诊；温度太低展片不充分，组织切片易皱褶，影响观察。组织切片应在水中充分伸展后裱贴，还可将切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起放入展片箱展片更易展平。烤片温度要适当，一般组织切片烤片多直接平放在50～55℃烤片机上10min，然后80℃电吹风2min左右为宜。温度高、时间长，易发生组织“焦糊”现象。温度低、时间短，切片太厚脱蜡不尽或染色过程中容易发生脱片；染色、封片要细心，苏木精-伊红染色是病理技术中最基本的方法，在病理技术中广泛应用，必不可少。因淋巴结细胞核比较大，细胞质较少，与其他组织切片一起染色，容易使苏木精深染，伊红着色浅。淋巴结切片与其他组织切片分别进行染色，根据苏木精成熟程度控制染色时间，苏木精染色时间短，一般2～3min，染色过程中0.5%～1.0%盐酸乙醇的分化是 HE染色成败的关键［10］，分化时间必须严格掌握，一定要恰到好处，分化不足时切片会呈现一片蓝染，同时会影响伊红上色，使切片层次不清，影响观察。分化过度时，可适当延长返蓝时温水的时间，返蓝不足时，不可进行伊红染色，否则会发生切片过于红染，同样影响观察，苏木精染色深浅和分化时间只能通过镜下观察来控制染色效果。

总之，淋巴结切片的制片是非常复杂细致的工作，在操作过程中每一环节都要求病理技术工作者规范操作，认真仔细对待，而且还要在实际操作过程中不断摸索，总结经验。只有这样才能给病理诊断提供优质可靠的淋巴结切片，给正确的病理诊断提供有力的技术保障。

［1］何燕，马恒辉，王璇，等.淋巴组织制片中常见问题与对策［J］.诊断病理学杂志，2011，18（2）：147-149.

［2］陈晨，杨晓静，傅春燕.淋巴结制片的几点探讨［J］.医学临床研究，2007，11（11）：2005-2006.

［3］宋容.新配方B-5固定液在HE制片中的应用探讨［J］.重庆医学，2006，35（12）：1115-1116.

［4］姜冰，杨军，彭长缨.淋巴结片子染色中苏木精染色时间的探讨［J］.诊断病理学杂志，2010，17（3）：238.

［5］王德田，罗玉凤，曹金伶，等.如何制作精良的淋巴结组织切片［J］.诊断病理学杂志，2005，12（4）：314.

［6］王琳，何乐健.三种不同固定液固定淋巴结所制切片的比较［J］.临床与实验医学杂志，2005，4（3）：170-171.

［7］Bancroft JD，Gamble M.周小鸽，刘勇，译.组织学技术的理论与实践［M］.北京：北京大学医学出版社，2010：45-61.

［8］龚志锦，詹熔洲.病理组织制片和染色技术［M］.上海：上海科学技术出版社，1994：5.

［9］康源，刘卫平.淋巴结常规制片技术体会［J］.临床与实验病理学杂志，2008，24（2）：235-236.

［10］姜元庆.病理检验技术［M］.北京：人民卫生出版社，2002：54-60.