子宫内膜癌端粒酶催化亚单位表达与DNA含量的相关性研究

赵文波，樊爱军，楼正青，王育瑛

（浙江省杭州市中医院检验科，浙江杭州310007）

·论 著·

子宫内膜癌端粒酶催化亚单位表达与DNA含量的相关性研究

赵文波，樊爱军，楼正青，王育瑛

（浙江省杭州市中医院检验科，浙江杭州310007）

目的探讨子宫内膜组织中端粒酶催化亚单位（human telomerase reverse transcriptase，hTRT）表达与DNA含量对子宫内膜癌的诊断意义以及二者之间的关系。方法采用原位杂交法对子宫内膜癌40例、子宫内膜不典型增生20例及正常子宫内膜组织8例的hTRT表达进行检测；用流式细胞仪检测3种组织细胞的DNA含量。结果子宫内膜癌组织hTRT表达阳性率为87.5％，明显高于正常子宫内膜与子宫内膜不典型增生组织（P＜0.01）；而且子宫内膜不典型增生组织hTRT表达阳性率（40.0％）高于正常子宫内膜（12.5％）。从正常子宫内膜到子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌，DNA指数值与S期细胞百分比值逐渐增高（P＜0.05）。hTRT阳性肿瘤组织中异倍体肿瘤（28/35）明显高于hTRT阴性肿瘤组织（1/5）。结论从正常子宫内膜到子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌，hTRT表达阳性率及DNA含量逐渐增高，提示hTRT阳性表达和DNA含量的增高与子宫内膜癌的发生发展高度相关，对子宫内膜癌的诊断具有重要意义。

子宫内膜肿瘤；端粒，末端转移酶；诊断

子宫内膜癌是危害女性健康的主要恶性肿瘤之一，近年来，其发病率呈上升趋势。对子宫内膜癌及时而准确的诊断是降低其病死率的关键，因此，人们

一直在努力寻找子宫内膜癌诊断的理想指标。端粒酶活化是正常组织细胞向恶性演变过程中的重要步骤，端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTRT）又称端粒酶催化亚单位，是端粒酶的重要组成部分，与酶活性密切相关，被认为是激活端粒酶的限速酶［1］。目前，端粒酶及其组分与恶性肿瘤的关系已引起人们的广泛关注。本研究采用原位杂交法分别检测正常、不典型增生及癌变子宫内膜组织hTRT的表达，同时采用流式细胞术检测其DNA含量，探讨hTRT及DNA含量在子宫内膜癌发生发展过程中的作用并初步揭示二者之间的关系，以期为子宫内膜癌的临床诊断及治疗提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源：68例子宫内膜组织石蜡切片取材时间为2008年6月—2010年9月。患者年龄28～79岁，中位年龄60岁。子宫内膜癌40例，其中高分化癌11例，中分化癌23例，低分化癌6例；子宫内膜不典型增生20例，其中轻度不典型增生6例，中度不典型增生12例，重度不典型增生2例；正常宫内膜组织8例，其中增殖期5例，分泌期3例。所有标本均经病理确诊。每例标本切取4μm、50μm切片各3张。

1.2 主要试剂及设备：hTRT原位杂交试剂盒由北京大学医学部病理教研室提供；FACSCalibur流式细胞仪及Cycle TESTTMPLUSDNA REAGENT KIT试剂盒为美国B-D公司产品。

1.3 hTRT检测：按原位杂交试剂盒说明书进行操作，4μm组织切片常规脱蜡、水化→0.3％H2O2封闭→0.1mol/L HCl处理→蛋白酶K消化→4％多聚甲醛后固定→滴加杂交液20μL/片，封口膜覆盖后放入含50％甲酰胺2×柠檬酸盐缓冲液的湿盒中，42℃杂交过夜，PBS代替探针作阴性对照→切片于2×柠檬酸盐缓冲液中洗3次→马血清封闭后滴加辣根过氧化物酶标记链霉素含素→二氨基联苯胺-H2O2显色，苏木素复染，中性树脂封片镜检。显微镜下观察，胞质中出现棕黄色颗粒为hTRT阳性。弱阳性（+），阳性信号面积＜25％；阳性（++），阳性信号面积25％～50％；强阳性（+++），阳性信号面积＞50％。无棕黄色颗粒出现者为hTRT阴性。

1.4 DNA含量分析：每例标本取50μm组织片3张置于大试管中，常规脱蜡、水化；每管加柠檬酸盐缓冲液5mL，置80℃2h［3］，离心弃上清；加0.5％胃蛋白酶消化液4mL（生理盐水配制，用HCl调pH值为1.5），37℃水浴孵育30min，消化期间，每隔5 min振荡悬浮1次；加生理盐水终止消化，1 500r/min离心5min，弃上清；加5mL PBS，800r/min离心2min去除细胞碎片；200目尼龙网滤去未消化组织碎片，收集滤液，PBS离心洗涤2次，显微镜下计数，调节每管细胞数为5×105，离心弃上清；加试剂盒A液250μL，室温10min；加B液200μL，室温10min；加C液200μL，4℃避光10min；500目尼龙网过滤，流式细胞仪检测。标本检测前，以DNA QC PARTICLES试剂盒校正流式细胞仪，调节电压及荧光强度。以淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞作为外标样品，与子宫内膜细胞同时进行流式细胞仪分析。每份标本收取15 000个细胞。以DNA指数（DNA index，DI）表示相对DNA含量，DI=样品G0/G1期峰均道值/正常子宫内膜G0/G1期峰均道值。严格来说，二倍体或四倍体细胞的DI值应为1或2，但由于石蜡切片在处理过程中会产生碎片，检验方法学也会存在误差，均会导致一些变异。故一般将二倍体的DI值定为0.9～1.1，DI值在此范围之外者则为异倍体。最后，采用B-D公司提供的ModFit LT软件进行细胞周期分析，计算标本的S期细胞百分比（S phase fraction，SPF）。

1.5 统计学方法：应用SPSS10.0统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示，采用方差分析；相关性采用Spearman相关分析；计数资料以百分率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 hTRT表达情况：hTRT阳性信号主要位于细胞质内，为棕黄色颗粒。正常子宫内膜组织hTRT阳性表达较少见且为弱阳性；子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌组织hTRT表达主要为阳性，并且子宫内膜癌组织hTRT表达出现较多的强阳性。子宫内膜癌组织hTRT阳性率为87.5％（35/40），正常子宫内膜组织hTRT阳性率为12.5％（1/8），二者相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；子宫内膜不典型增生组织hTRT阳性率为40％（8/20），与正常子宫内膜组织差异无统计学意义（P＞0.05），与子宫内膜癌组织相比差异有统计学意义（P＜0.01）。从正常、不典型增生到癌变子宫内膜，hTRT阳性强度逐渐增强（rs=0.605，P＜0.01）。见表1。

表1 子宫内膜组织hTRT表达Table 1 Expression of hTRT in endometrial tissue

2.2 DNA含量检测结果：8例正常子宫内膜组织细胞DNA含量均为二倍体，DNA以G0/G1期细胞群为主，S期细胞峰光滑平坦，G2M期细胞出现小峰；20例不典型增生子宫内膜中二倍体12例，DNA显示S期细胞峰稍高，G2M期细胞峰亦有增高；40例子宫内膜癌组织中二倍体11例，DNA显示S期及G2M期细胞峰均高于正常子宫内膜组织。异倍体不典型增生及异倍体肿瘤细胞出现明显的异倍体峰。子宫内膜癌组织异倍体率为72.5％（29/40），明显高于子宫内膜不典型增生组织（P＜0.05）及正常子宫内膜（P＜0.01）；子宫内膜不典型增生组织异倍体率为40.0％，与正常子宫内膜相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。从正常、不典型增生到内膜癌组织，DI值及SPF值逐渐增高（P＜0.05）。见表2，3。

表4 子宫内膜癌组织hTRT表达与DNA倍体的关系Table 4 Endom etrial cancer tissue hTRT exp ression and DNA p loidy relationship （n）

表2 3种子宫内膜组织DNA倍体Table 2 Three kinds of endometrial tissues DNA ploidy

表3 子宫内膜组织DI值及SPF值分布Table 3 Endometrial tissue DI value andSPF value distribution （±s）

表3 子宫内膜组织DI值及SPF值分布Table 3 Endometrial tissue DI value andSPF value distribution （±s）

*P＜0.05 vs normal #P＜0.05 vs typical hyperplasia by ANOVA test

Endometrial tissues n DI SPF（％）Normal 8 1.01±0.07 8.21±2.30 Typical hyperplasia 20 1.16±0.13*13.66±3.22*Endometrial carcinoma 40 1.43±0.18*#23.62±4.69*#

2.3 子宫内膜癌组织hTRT表达与DNA倍体的关系：hTRT表达阴性的子宫内膜癌组织多为二倍体，异倍体仅占20％（1/5）；hTRT表达阳性者则多为异倍体，异倍体比例为80.0％（28/35）。hTRT表达阳性肿瘤组织异倍体率明显高于阴性肿瘤组织（P＜0.05），hTRT表达与DNA倍体之间存在一定联系（rs=0.44，P＜0.01）。见表4。

3 讨 论

3.1 hTRT检测对子宫内膜癌的诊断意义：研究［2］表明大多数人类恶性肿瘤及永生化细胞中端粒酶活性显著增高，端粒酶活化与细胞的异常增殖密切相关，在肿瘤的发生发展中起非常重要的作用。hTRT的表达与端粒酶的活性表达完全一致，在原发性肿瘤、癌细胞系以及端粒酶阳性表达的组织中hTRT均有较高表达［3］。检测hTRT的表达已成为端粒酶活性检测的又一主要方法。Oshita等［4］对36例子宫内膜癌的端粒酶活性和hTRT表达进行了检测，结果发现端粒酶活性与hTRT的阳性率基本一致，并且均明显高于正常子宫内膜。本研究采用原位杂交法检测hTRT在子宫内膜石蜡包埋组织中的表达，即可间接反映出端粒酶活性的高低，又克服了以往方法标本限制问题。本研究结果表明，hTRT主要表达于细胞质中，40例子宫内膜癌组织中有35例hTRT阳性，阳性率87.5％，明显高于正常及不典型增生子宫内膜组织，与文献报道接近［5］。在8例正常子宫内膜组织中，有1例hTRT阳性。由于子宫内膜癌多发生于绝经后妇女，因此，hTRT检测对于子宫内膜癌的诊断仍具有重要价值。

3.2 子宫内膜癌的DNA含量变化：肿瘤细胞特别是恶性肿瘤细胞的DNA含量多有不同程度的升高，DNA异倍体的出现则是恶性肿瘤的特征性标志之一。随着流式细胞术在肿瘤研究中的广泛应用，DNA含量分析与肿瘤临床因素的关系引起人们越来越多的关注。国内外学者一致认为，DNA倍体分析可作为评价预后的独立指标［6］。关于DNA含量分析在子宫内膜癌诊断方面的意义，目前国内外报道极为少见。张蓉等［7］采用流式细胞术对30例子

宫内膜癌患者肿瘤新鲜组织进行DNA含量分析，结果异倍体率为56.7％。本研究40例子宫内膜癌中异倍体29例，异倍体率72.5％，内膜癌组DNA异倍体率明显高于正常组及不典型增生组。究其原因很可能是我们采用的石蜡切片标本在细胞制备过程中产生的细胞碎片较多，致使测试结果偏高。从正常子宫内膜到子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌，DI值与SPF值逐渐增高。这表明DNA含量变化与子宫内膜癌演进过程密切相关，DNA含量分析对子宫内膜癌的诊断及其与癌前病变的鉴别诊断具有重要价值，增生子宫内膜中出现较高DI值及SPF值可能提示恶变几率的升高。

3.3 hTRT的表达与DNA含量分析：hTRT表达与DNA含量异常之间可能存在某种联系，在细胞分裂过程中，端粒逐渐缩短，细胞停止分裂退出细胞周期而凋亡。由此可见，端粒的持续缩短降低了染色体的稳定性，使染色体容易发生畸变，此时细胞便表现为异倍体，同时端粒的过度缩短也是端粒酶激活的重要原因。本研究中hTRT阳性的内膜癌组织异倍体占80.0％，hTRT阴性者异倍体占20.0％，hTRT阳性内膜癌的异倍体率明显高于hTRT阴性者。有学者［8-9］认为异倍体肿瘤端粒酶活性明显高于非异倍体肿瘤。本研究结果显示hTRT表达与DNA倍体之间存在一定联系，表明二者联合检测能进一步提高子宫内膜癌诊断的准确性，同时也提示hTRT可能对子宫内膜癌的预后判断具有一定意义。由于本研究患者无随访资料，有关hTRT表达与子宫内膜癌预后的关系尚有待研究。此外，因样本例数较少，有关hTRT表达及DNA含量与子宫内膜癌组织学类型、病理分级的关系也有待于进一步研究。

［1］PALANI J，LAKSHMINARAYANAN V，KANNAN R. Immunohistochemical detection of human telomerase reverse transcriptase in oral cancer and pre-cancer［J］.Indian JDent Res，2011，22（2）：362-363.

［2］左连富，刘洪祥，郭建文，等.流式细胞术检测石蜡包埋肿瘤细胞DNA含量的样品制备方法［J］.中华病理学杂志，2008，17（3）：232-233.

［3］文杰，吴勇军，唐仪.宫颈无明确意义的非典型鳞状细胞的临床意义及处理［J］.河北医科大学学报，2011，32（8）：943-944.

［4］OSHITA T，NAGAI N，OHAMA K.Expression of telomerase reverse transcriptasemRNA and its quantitative analysis in human endometrial cancer［J］.Int JOncol，2009，17（6）：1225-1230.

［5］CONG Y，SHAY JW.Actions of human telomerase beyond telomeres［J］.Cell Res，2008，18（7）：725-732.

［6］PARK JI，VENTEICHER AS，HONG JY，et al.Telomerase modulatesWnt signalling by association with target gene chromatin［J］.Nature，2009，460（7251）：66-72.

［7］张蓉，许培箴，虞斌.子宫内膜癌瘤组织DNA定量检测的临床意义［J］.南京医科大学学报：自然科学版，2009，26（12）：1239-1241.

［8］李欣，张志刚，孙金豹，等.Kiss-1在子宫内膜病变中的表达及意义［J］.河北医科大学学报，2011，32（8）：893-894.

［9］OKUSA Y，SHINOMIYA N，ICHIKURA T，et al.Correlation between telomerase activity and DNA ploidy in gastric cancer［J］. Oncology，2010，55（3）：258-264.

（本文编辑：赵丽洁）

EXPRESSION OF HUMAN TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE AND DNA CONTENT IN ENDOMETRIAL CARCINOMA

ZHAOWenbo，FAN Aijun，LOU Zhengqing，WANG Yuying
linical Laboratory，Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang Province，Hangzhou 310007，China）

Objective To investigate the value of human telomerase reverse transcriptase（hTRT）and DNA contents in the diagnosis of endometrial carcinoma and to evaluate the relationship between the expression of hTRT and DNA content in endometrial carcinoma.MethodsThe expression of hTRT in 40 cases of endometrial carcinoma，20 cases of endometrial atypical hyperplasia and 8 cases of normal endometrium were detected by in situ hybridization.The DNA contents of the three kinds of tissue were detected by flow cytometry.ResultsThe positive rate of hTRT in endometrial carcinoma（87.5％）was remarkably higher than those in endometrial atypical hyperplasia（40.0％）and normal endometrium（12.5％），respectivel（y P＜0.01）.The difference of DNA index and S-phase fraction among the three groups were significant（P＜0.05）.The aneuploid rate（28/35）of hTRT-positive carcinoma was significantly higher than that（1/5）of hTRT-negative（P＜0.05）.ConclusionFrom normal endometrium to endometrial atypical hyperplasia and endometrial carcinoma，the expression of hTRT and DNA content increased gradually，indicating hTRT positive expression and increased DNA content being closely related to the progress of endometrial carcinoma，both of them played important role in the diagnosis of endometrial carcinoma.

endometrial neoplasms；telomerase；diagnosis

R737.33

A

1007-3205（2013）06-0674-04

2012-10-22；

2013-01-29

赵文波（1974-），男，浙江杭州人，浙江省杭州市中医院主管技师，医学硕士，从事免疫学检验及相关研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.06.020