反相高效液相色谱法测定秋葵干蔬中的β-胡萝卜素

董爱军，杨 鑫，张英春，张 华，井 晶

（哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090）

秋葵是一种高档营养保健蔬菜，它是名副其实的药食兼备的高营养强身健体植物[1]，既可以作为蔬菜直接食用，也可以作为汤料的辅助成分，以及蛋白质和脂肪的替代品[2-3]。但秋葵储存期短，即使低温储存，也只有2～3d的保鲜期。为了延长秋葵的储存期，传统的方法是将秋葵烘干或晒干制成秋葵干蔬[4]，速冻也是常用的保鲜方法，速冻产品保鲜期可达9个月[5]，干制产品最长可保存一年。

为了评价秋葵的营养保健价值，人们对于秋葵中功能成分及营养成分进行了深入的研究，如多酚化合物[6]、多糖[7]、微量元素[8]等药用成分的分析研究，蛋白质、糖、脂肪等营养成分的测定[9-10]，胡萝卜素和类胡萝卜素的组成分析等[11-12]。秋葵嫩荚富含维生素，尤其是维生素A与胡萝卜素含量在目前发现的动植物中位列第一。β-胡萝卜素是维生素A的前体，同时β-胡萝卜素具有很强的抗氧化功能[13]和抑制肿瘤细胞生长的作用[14-15]。但β-胡萝卜素不稳定，极易被光、热、氧、金属离子等破坏，因此研究分析秋葵干蔬中β-胡萝卜素的含量，对于选择适当的干制方法具有指导意义，同时对于评价秋葵干蔬的营养价值和保健价值也有重要的意义。液相色谱法以其灵敏度高，快速准确，操作简单等特点在β-胡萝卜素的测定中得到了广泛的应用[16-19]，但大部分方法采用回流皂化法，样品处理繁琐，很难实现全程避光，β-胡萝卜素的破坏较大。本实验简化样品处理过程，建立了RP-HPLC测定秋葵干蔬中β-胡萝卜素含量的方法。该方法样品处理方法简单，β-胡萝卜素的破坏较小，测定结果准确。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

β-胡萝卜素 Sigma公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷 为色谱纯；氢氧化钾、无水硫酸钠、抗坏血酸、无水乙醇 为分析纯。

Agilent 1100型高效液相色谱仪 美国Agilent公司，配备四元梯度泵，100位自动进样器，二极管阵列检测器（DAD），化学工作站；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；millipore purification system超纯水系统 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 干燥秋葵样品用粉碎机粉碎后，过20目筛，备用。准确称取10.00g粉碎的秋葵样品于250m L具塞锥形瓶中，加1g抗坏血酸，再加入70m L无水乙醇，混匀，加入30m L 50%的KOH溶液，充入氮气5m in，盖好瓶塞，并用保鲜膜和皮筋将瓶塞扎实，锡箔纸包好后，室温下放置过夜皂化22～24h。用150m L正己烷分3次萃取皂化液，合并正己烷层，并用高纯水将其洗至中性后，过无水硫酸钠脱水。在45℃下旋转蒸发至近干，用正己烷定容至10m L，经0.45μm微孔滤膜过滤后，取20μL进行液相色谱分析。整个操作过程注意避光。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为Agilent TC-C18柱（250mm×4.6mm，i.d.5μm）；流动相为乙腈-甲醇-乙酸乙酯（88∶10∶2，V∶V∶V），流速1m L/min；柱温30℃；进样量20μL；检测波长为453nm。

1.2.3 标准溶液配制

1.2.3.1 标准储备液和标准使用液 准确称取β-胡萝卜素标准品0.1000g，用正己烷溶解并准确定容于100m L棕色瓶中，配制成浓度为1000mg/L的标准储备液，于-20℃冰箱中避光保存。准确吸取该标准储备液10m L，用正己烷定容至100m L，配制成浓度为100mg/L的标准使用液，于4℃冰箱中避光保存。此标准使用液需现用现配。

1.2.3.2 标准系列溶液 准确吸取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0m L标准使用液于100m L棕色瓶中，用正己烷定容，配制成β-胡萝卜素浓度分别为0.1、0.5、1、2、5、10mg/L的系列标准工作溶液。标准工作溶液需现用现配。

1.2.4 定量方法 取各浓度标准工作溶液按上述色谱条件进行分析，以峰面积对质量浓度绘制标准曲线，并进行线性回归。将处理后的样品溶液在相同条件下进行分析，以保留时间定性，外标法定量。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的选择

β-胡萝卜素是一种脂溶性的物质，存在于脂肪之内。干秋葵种子中含有较多的脂肪，为了使样品中的β-胡萝卜素与脂肪分离，本实验采用传统的皂化法处理样品。β-胡萝卜素不稳定，光、氧、热和金属离子都能使其分解损失，尤其对光极不稳定。为了保证测定结果的准确度，减少β-胡萝卜素的损失，采用室温过夜皂化法。加入抗坏血酸作为抗氧化剂，同时充入氮气以防止β-胡萝卜素氧化，在室温下皂化以防止β-胡萝卜素的受热损失，为了防止光对β-胡萝卜素的破坏，整个样品处理过程都避光。本实验比较了正己烷、石油醚、乙醚的萃取效果，用正己烷萃取时，β-胡萝卜素回收率比其他两种萃取剂高10%左右，因此本实验选择正己烷为β-胡萝卜素的萃取剂。

2.2 色谱条件选择

2.2.1 流动相的选择 反相高效液相色谱法测定β-胡萝卜素的流动相有乙腈-二氯甲烷-甲醇[17，19]、甲醇-乙腈-三乙胺[18]、环己烷-正己烷-异丙醇[20]、乙腈-甲醇-乙酸乙酯[21]、甲醇-异丙醇[22]等，本实验选择乙腈-甲醇-乙酸乙酯作流动相，并对三者的配比进行了实验，分别为：88∶10∶2，90∶5∶5，95∶0∶5。由于β-胡萝卜素含有共轭双键，极性很弱，因此提高乙腈和乙酸乙酯的比例能使保留时间缩短，但实验中发现，随着乙腈和乙酸乙酯的增加，β-胡萝卜素的保留时间虽然有所缩短，但峰面积却小了很多，综合考虑最终确定乙腈-甲醇-乙酸乙酯的比例为88∶10∶2，β-胡萝卜素的保留时间为45m in。

2.2.2 检测波长的选择 液相色谱法测定β-胡萝卜素的检测波长有250nm[19]、450nm左右[16，19-20，22]，实验前用二极管阵列检测器在190～900nm范围内，对β-胡萝卜素标准溶液进行在线光谱扫描，光谱信号显示：β-胡萝卜素在453nm有最大吸收峰。本实验比较了β-胡萝卜素在250、450、453nm的吸收值，结果表明β-胡萝卜素在453nm的吸收值更高一些，这与在线光谱扫描的结果一致。因此本实验确定在453nm波长下检测秋葵中的β-胡萝卜素，标准品和干燥秋葵加标样品色谱图，见图1。

图1 β-胡萝卜素标准品和秋葵干蔬加标样品色谱图Fig.1 Chromatograms ofβ-carotene standard and dry okra sample spiked 100μg

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围和检出限 将混合标准系列溶液按

1.2.2 的色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标（y），标准溶液浓度（mg/L）为横坐标（X），作工作曲线并进行线性回归，β-胡萝卜素在0.1～10.0mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=104.13x+39.62，相关系数R2=0.996。按3倍信噪比（S/N），确定本方法的检出限（LOD）为0.08mg/kg，10倍信噪比（S/N），确定本方法的定量下限（LOQ）为0.26mg/kg。

2.3.2 回收率和精密度 准确称取干燥秋葵样品10.00g，按高、中、低三个浓度水平加标，每个水平重复三次，进行回收率和精密度实验，由回归方程计算回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表1。β-胡萝卜素的回收率为82.4%～94.0%，相对标准偏差（RSD）为2.28%～5.43%，表明本方法的准确度和精密度都较高，能够满足实际测定需要。

表1 回收率与相对标准偏差（n=3）Table1 Recovery ofβ-carotene and relative standard deviation（n=3）

2.3.3 稳定性实验 光和热对β-胡萝卜素的稳定性有很大的影响，避光和4℃储存效果最佳[22]。为了考察β-胡萝卜素的稳定性，将浓度为5mg/L的β-胡萝卜素标准溶液在4℃下避光放置，每隔2h测定其响应值，并计算浓度。结果表明，β-胡萝卜素浓度变化的相对标准偏差（RSD），日内为3.58%，日间为6.73%。因此测定β-胡萝卜素时，为了减少损失，标准溶液应现用现配，并且标样配制和样品处理过程都应避光，低温放置。

2.4 秋葵干蔬中测定

采用上述方法测定了10个秋葵干蔬样品中的β-胡萝卜素的含量，每个样品重复测定3次，结果均未检出β-胡萝卜素。鲜秋葵中β-胡萝卜素的含量平均为92.4mg/kg，本实验中的样品是在阳光下自然晒干的，由于紫外线对β-胡萝卜素的破坏力极强，未检出说明自然晒干的秋葵干蔬中的β-胡萝卜素已经被完全破坏了。

3 结论

本实验建立了测定秋葵干蔬中β-胡萝卜素的反相高效液相色谱法，样品经室温过夜皂化后，由C18柱分离，二极管阵列检测器检测。该方法灵敏度高，重现性好，不仅适合干制秋葵中β-胡萝卜素的测定，也可应用于新鲜秋葵和速冻秋葵中β-胡萝卜素的测定。该方法的建立对于选择适宜的秋葵保鲜方法，减少β-胡萝卜素的损失具有指导意义。

[1]Watson R R，Preedy V R.Bioactive food as dietary interventions for diabetes[M].California：Acadenuc Press，2013：291-306.

[2]Costantino A J，Romanchick-Cerpoviez J E.Physical and sensory measures indicate mode rate fat replacement in frozen dairy dessert is feasible using okra gum as amilk-fat ingredient substitute[J].Journal of the American Dietetic Association，2004，104（Suppl.2）：44.

[3]Romanchik-Cerpovicz J E，Costantino A C，Laura H G.Sensory evaluation ratings and melting characteristics show that okra gum is an acceptable milk-fat ingredient substitute in chocolate frozen dairy dessert[J].Journalof the American Dietetic Association，2006，106：594-597.

[4]Adorn K K，Dzogbefia V P，Ellis W O，et al.Solar drying of okra——effects of selected materials on storage stability[J].Food Research International，1996，29（7）：589-593.

[5]黄绍力，邓红生，叶世豪.黄秋葵速冻保鲜研究[J].保鲜与加工，2002（2）：13-15.

[6]Arapitsas P.Identification and quantification of polyphenolic compounds from okra seeds and skins[J].Food Chemistry，2008，110（4）：1041-1045.

[7]Sheu S C，Lai M H.Composition analysis and immunomodulatory effect of okra（Abelmoschus esculentus L.）extract[J].Food Chemistry，2012，134（4）：1906-1911.

[8]Adelakun O E，Ade-Omowaye B IO，Adeyemi IA，et al.Mineral composition and the functional attributes of Nigerian okra seed（Abelmoschus esculentus Moench） flour[J].Food Research International，2012，47（2）：348-352.

[9]Adelakun O E，Oyelade O J，Ade-Omowaye B IO，et al.Chemical composition and the antioxidative properties of Nigerian Okra Seed（Abelmoschus esculentus Moench）Flour[J].Food and Chemical Toxicology，2009，47（6）：1123-1126.

[10]黄阿根，陈学好，高云中，等.黄秋葵的成分测定与分析[J].食品科学，2007，28（10）：451-455.

[11]Fuh JK，Yu SC，May JT，etal.Effects of Chinese domestic cooking methods on the carotenoid composition of vegetables in Taiwan[J].LWT-Food Science and Technology，2012，46（2）：485-492.

[12]Muhammad J，EL-Qudah.Identification and quantification ofmajor carotenoids in some vegetables[J].American Journal of Applied Sciences，2009，6（3）：492-497.

[13]Zhang P，Omaye S T.Antioxidant and prooxidant roles for β-carotene，α-tocopherol and ascorbic acid in human lung cells [J].Toxicology in Vitro，2001，15（1）：13-24.

[14]Dulin’ska J，Gil D，Zagajewski J，et al.Different effect of beta-carotene on proliferation of prostate cancer cells[J].Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease，2005，1740（2）：189-201.

[15]Steinel H H，Baker R S U.Effects ofβ-carotene on chemically-induced skin tumors in HRASkh hairless mice[J].Cancer Letters，1990，51（2）：163-168.

[16]Prates J A M，Quaresma M A G，Bessa R J B，et al.Simultaneous HPLCquantification of total cholesterol，tocopherols andβ-carotene in Barrosa-PDO veal[J].Food Chemistry，2006，94（3）：469-477.

[17]Kandlakunta B，Rajendran A，Thingnganing L.Carotene content of some common（cereals，pulses，vegetables，spices andcondiments）and unconventional sources of plant origin[J].Food Chemistry，2008，106：85-89.

[18]Barba A IO，Hurtado M C，Mata M C S，et al.Application of a UV-vis detection-HPLC method for a rapid determination of lycopene andβ-carotene in vegetables[J].Food Chemistry，2006，95：328-336.

[19]HosotaniK，KitagawaM.Improved simultaneousdetermination method ofβ-carotene and retinol with saponification in human serum and rat liver[J].Journal of Chromatography B，2003，791（1-2）：305-313.

[20]王旻，钱永军，鄂来明，等.营养强化剂和婴儿配方奶粉中β-胡萝卜素的测定[J].中国乳品工业，2005，33（6）：56-57.

[21]Ismail A，Cheal SF.Determination of Vitamin C，β-carotene and riboflavin contents in five green vegetables organically and conventionally grown[J].Malaysian Journal of Nutrition，2003，9（1）：31-39.

[22]罗燕春，韦吉，黎军平，等.黄秋葵叶粉中叶黄素和β-胡萝卜素的稳定性[J].中国农学通报，2008，24（7）：85-91.