七种试剂对单针藻的絮凝作用

刘平怀，张 玲，罗 宁

（海南大学材料与化工学院，海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南海口570228）

单针藻（Monoraphidium sp.）是具有较高的科研及经济价值的微藻，有着极大地应用潜力。研究发现，单针藻是生产生物柴油的优良藻株[1-3]，亦可用来生产虾青素[4]。单针藻细胞为不规则的宽纺锤形，呈直或略弯，细胞宽约4～8μm，长约12～26μm，由于其特殊的微小个体，采用传统的固液分离方法会堵塞滤膜而使得过滤失效；另外，微藻细胞悬浮于水中无法自然沉降，且在开放培养体系中浓度很低（一般为0.5～3g/L）[5]，极大地增加了离心收集的成本。有研究表明，微藻的采收成本占其生产成本的20%～30%[6]，因此寻找高效的采收技术以降低微藻培养成本十分重要，国内外通常采用的方法是将微藻培养液浓缩。在藻液中添加絮凝剂是微藻采收过程中常用的一种技术[7]，常用的絮凝剂包含无机和有机试剂，如硫酸铝、硫酸铝钾、氢氧化钙、聚合氯化铝、聚丙烯酰胺和壳聚糖等。目前国内外较少报道关于单针藻的絮凝采收。本文考察了硫酸铝钾、硫酸铝、氢氧化钙、氯化铁、氯化铝、聚丙烯酰胺、壳聚糖7种试剂对单针藻的絮凝效应，以期找到适合单针藻浓缩的絮凝剂，为单针藻采收提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

单针藻（Monoraphidium sp.） 分离自海南儋州，现保存于海南大学生物工程实验室；硫酸铝钾（KA l（SO4）2，AR，纯度＞99.5%）、氢氧化钙（Ca（OH）2， AR，纯度＞95.0%）、聚丙烯酰胺（AR，纯度＞90.0%）天津永大化学试剂；硫酸铝（Al2（SO4）3，AR，纯度＞99.0%）、氯化铁（FeCl3，AR，纯度＞99.0%）、氯化铝（AlCl3，AR，纯度＞97.0%） 广州化学试剂；壳聚糖BR，脱乙酰度80.0%～95.0%，国药集团化学试剂。

CR22GⅡ型高速冷冻离心机日立；LGJ-25C型冷冻干燥机 北京四环仪器；IX71型倒置显微镜 奥林帕斯；TU-1810型紫外可见分光光度计 普析通用。

1.2 培养基及培养条件

单针藻培养采用BG-11液体培养基（参照美国德州大学藻种库配方），100L大桶通气培养，大桶置于室外阳台，培养10d后取藻液，8000r/min离心，收集藻泥，冷冻干燥机冻干，藻粉存储于-20℃冰箱备用。

1.3 实验设计

1.3.1 单针藻藻体干重与光密度值的关系

1.3.1.1 单针藻最大吸收波长的确定 称取一定量的单针藻藻粉，用蒸馏水配制成浓度为0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000g/L的藻液，采用紫外可见分光光度计做全波长扫描，根据光密度值确定其在不同浓度下的最大吸收波长。

1.3.1.2 单针藻藻体干重与光密度值标准曲线的绘制 取单针藻藻粉，用蒸馏水配制成浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6g/L，在最大吸收波长下测定其吸光度值，依据吸光度值绘制藻体干重与光密度值的标准曲线：y=a x+b，其中x为藻体干重，y为吸光度值。

1.3.2 不同絮凝剂对单针藻絮凝效率的研究 本次实验共采用7种絮凝剂，分别为：KA l（SO4）2、A l2（SO4）3、Ca（OH）2、FeCl3、A lCl3、聚丙烯酰胺、壳聚糖。取絮凝剂以0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L七种浓度，添加到单针藻藻液中（OD680值约为2.5），其中壳聚糖组使用醋酸调节pH至5.5。混合液迅速搅拌数秒，每隔一段时间测定吸光度值，每组设置2个平行实验，以絮凝效率衡量，计算公式如下：

絮凝效率（%）=（y0-yt）/（y0-b）×100

式中，y0为单针藻藻液的初始吸光度值，yt为时间t测得藻液吸光度值，b为标准曲线（y=ax+b）中截距b。

1.3.3 絮凝剂对单针藻细胞破坏程度的研究 取单针藻絮凝层，加入到24微孔细胞培养板中，采用倒置显微镜观察单针藻细胞絮凝状态，考察不同絮凝剂对单针藻细胞破坏程度。

2 结果与分析

2.1 单针藻藻体干重与光密度值的关系

不同浓度的单针藻藻液全波长扫描结果如图1所示，由图1可知，在浓度为0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000g/L下，单针藻藻液最大吸收波长均为680nm，这一结果与目前大部分文献中微藻培养检测所采用的波长一致，由此可以确定单针藻培养过程中的检测波长为680nm。

由单针藻藻体干重与光密度值的关系所得标准曲线如图2所示，由图2可知，在藻液浓度为0.05～1.2g/L的范围内，单针藻藻体干重与吸光度值存在线性关系，即，y=2.06x+0.201，R2=0.9814。因此，在此浓度范围内可根据所测得的吸光度值计算藻液中藻体干重。

图1 单针藻500～900nm下波谱扫描Fig.1 Spectrum of the absorbency of different concentrations of Monoraphidium sp.at differentwavelength

图2 藻体干重与吸光度值的关系Fig.2 Relation of cell dry weight and OD680

2.2 不同絮凝剂对单针藻絮凝效率的研究

图3 KA（l SO4）2对单针藻絮凝效率Fig.3 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with aluminium potassium sulfate

2.2.1 KA l（SO4）2对单针藻的絮凝效率研究 如图3所示，KAl（SO4）2对单针藻的絮凝效率随浓度的增加而增强。当KAl（SO4）2浓度为0.1～0.6g/L时，絮凝效果不明显，330m in后絮凝效率仍低于30%；当KA l（SO4）2浓度为0.8g/L时，280m in后55%以上的藻体絮凝；当KAl（SO4）2浓度为1.0g/L时，20min后40%以上的藻体絮凝，280m in后65%以上的藻体絮凝。KA l（SO4）2对不同微藻絮凝效率不同，对铜绿微球藻和牟氏角毛藻絮凝效率较高，而对湛江等鞭金藻絮凝效率较差[8]。本次实验结果显示高浓度的KAl（SO4）2对单针藻具有较好的絮凝效率，但消耗大量KA l（SO4）2会极大增加微藻生产成本，因此，KAl（SO4）2不适合用于单针藻大规模培养絮凝采收。

2.2.2 A l2（SO4）3对单针藻的絮凝效率研究 如图4所示，A l2（SO4）3对单针藻的絮凝效率较高，随着浓度的增加絮凝效果较为明显。Al2（SO4）3浓度低于0.2g/L时，280m in后60%以上藻体絮凝；当A l2（SO4）3浓度大于0.4g/L时，单针藻藻体絮凝较快，10m in后70%以上的藻体絮凝，25m in后藻体完全絮凝。作为一种常用的无机絮凝剂，Al2（SO4）3在絮凝采收小球藻[9]、球等鞭金藻[10]、微绿球藻和三角褐指藻[11]等微藻时均获得了较好的效果。本次实验结果显示A l2（SO4）3对单针藻具有较好的絮凝效果，可用于单针藻的絮凝采收。

图4 Al2（SO4）3对单针藻絮凝效率Fig.4 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with aluminum sulfate

图5 Ca（OH）2对单针藻絮凝效率Fig.5 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with calcium hydroxide

2.2.3 Ca（OH）2对单针藻的絮凝效率研究 如图5所示，Ca（OH）2对单针藻的絮凝效率较低，其絮凝效率随浓度的增加而增大。当Ca（OH）2浓度低于0.6g/L时，240min后藻体絮凝效率低于20%，当Ca（OH）2浓度为0.8g/L时，20m in后有45%的藻体絮凝，但随着时间的增加剩余藻体未絮凝；当Ca（OH）2浓度为1.0g/L时，240m in后有70%的藻体絮凝。实验结果显示低浓度Ca（OH）2对单针藻絮凝效率低，高浓度的Ca（OH）2能够较好的絮凝单针藻，但由于Ca（OH）2浓度过高不仅会增加采收成本，还会极大增加藻液pH进而破坏藻体，因此不适合用于单针藻絮凝采收。

2.2.4 FeCl3对单针藻的絮凝效率研究 如图6所示，在FeCl3浓度低于0.4g/L的条件下，单针藻的絮凝效率随浓度的增加而增大，但FeCl3浓度高于0.6g/L时，絮凝效率下降。当FeCl3浓度为0.1g/L时，藻体10m in后即能絮凝40%，且随着时间增加藻体基本不再絮凝；当FeCl3浓度为0.2～0.4g/L时，絮凝效果较好，25m in即能絮凝95%以上藻体，50min后藻体完全絮凝；当FeCl3浓度为0.6g/L时，絮凝效率下降，仅为80%，当浓度增加到0.8～1.0g/L时，絮凝效果不明显，藻体在240m in后絮凝效率仍低于40%。絮凝剂过多不仅会破坏藻细胞，而且会使藻液中正电荷增多，过量的正电荷在系统中相互排斥，进而影响絮凝效果[9，12]。

图6 FeCl3对单针藻絮凝效率Fig.6 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with ferric chloride

2.2.5 AlCl3对单针藻的絮凝效率研究 如图7所示，A lCl3对针藻的絮凝效率和FeCl3类似，随A lCl3浓度的增加而增大，但过高的浓度会影响藻体的絮凝。当A lCl3浓度为0.1g/L时，藻体仅能絮凝25%；当A lCl3浓度为0.2g/L时，藻体仅能絮凝45%；当AlCl3浓度为0.4～0.8g/L时，藻体在20min后能完全絮凝；当AlCl3浓度增加到1.0g/L时，藻体基本不絮凝。

图7 AlCl3对单针藻絮凝效率Fig.7 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with aluminum chloride

2.2.6 聚丙烯酰胺对单针藻的絮凝效率研究 由图8可知，聚丙烯酰胺对单针藻几乎无絮凝作用。不同浓度下，藻液的沉降效果无明显差异，240m in后藻体基本不絮凝。

2.2.7 壳聚糖对单针藻的絮凝效率研究 采用浓度梯度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L的壳聚糖在pH=5.5的情况下絮凝单针藻，结果显示，当浓度大于0.1g/L时，15m in后单针藻能够完全絮凝。为考察壳聚糖最佳用量，设置浓度梯度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05g/L，结果如图9所示，当壳聚糖浓度为0.01g/L时，絮凝效率仅为10%；当浓度为0.02、0.03g/L时，最终絮凝效率为70%；当浓度为0.04、0.05g/L时，15m in后絮凝效率为100%。由此可见，壳聚糖的最佳用量为0.04g/L。壳聚糖作为一种天然高分子化合物，生物相容性好，无毒，能够生物降解，不会造成2次污染，使用壳聚糖采收的微藻可以应用于食品、医药和能源行业[13]，利用壳聚糖絮凝采收微藻后上清液可以再次利用培养微藻[14]。研究证实，壳聚糖在收集微藻中取得较好的效果[15-16]。实验结果显示壳聚糖有望用作单针藻大规模培养采收絮凝浓缩试剂。

图8 聚丙烯酰胺对单针藻絮凝效率Fig.8 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with polyacrylamide

图9 壳聚糖对单针藻絮凝效率Fig.9 Flocculation efficiency of Monoraphidium sp.with chitosan

2.3 絮凝剂对单针藻细胞完整性的影响

由不同絮凝剂对单针藻絮凝效率的研究可知，不同絮凝剂（聚丙烯酰胺除外）对单针藻的絮凝都有最适的絮凝浓度，本实验选取各絮凝剂的最适浓度和（或）最高浓度进行细胞完整性实验。取絮凝层藻液加入细胞培养板，采用倒置显微镜观察，考察不同絮凝剂对单针藻细胞破坏程度，结果如图10所示。

由图10可知，Ca（OH）2对单针藻细胞破坏较严重，部分藻细胞破裂，藻液中出现较小的碎片（图10d）。藻液中添加KA l（SO4）2、A l2（SO4）3后，单针藻细胞形成较大的絮凝块，大部分细胞保持较好的完整性（图10b～c）。向单针藻藻液中添加0.2g/L的FeCl3后，细胞絮凝较为明显，细胞损伤较小（图10e）；当FeCl3浓度为1.0g/L，藻细胞呈均匀分散，细胞完整性较好，但藻细胞基本不絮凝（图10f）；单针藻细胞在高、低浓度FeCl3中呈现不同的絮凝状态，可能原因是低浓度的FeCl3能够通过吸附架桥和网捕沉淀作用使单针藻细胞形成较大的絮凝块而沉淀，但过高浓度的FeCl3（＞0.6g/L）引入过量正电荷形成了较为均匀的分散体系而使得藻细胞无法絮凝。添加0.4g/L的AlCl3后，藻细胞形成较大的絮凝块，当A lCl3浓度增加到1.0g/L时，絮凝块变小，且细胞出现脱水（图10g～h），由此可见，高浓度的A lCl3会对单针藻细胞产生破坏而影响其絮凝效果。添加聚丙烯酰胺后细胞基本不絮凝，细胞形态也未受到影响（图10i）。添加壳聚糖后，单针藻细胞呈现均匀的整体絮凝块，细胞基本无损坏（图10j）。从絮凝剂对细胞破坏程度来看，采用壳聚糖絮凝采收单针藻对藻细胞影响较小，因此，选择壳聚糖为最佳絮凝剂。

图10 絮凝剂对单针藻细胞完整性的影响（×400）Fig.1 0 Effectof flocculants on Monoraphidium sp.cell integrity（×400）

3 结论

在所选7种试剂中，壳聚糖为单针藻浓缩采收的最佳试剂，当壳聚糖用量为0.04g/L时，15m in即能达到100%的絮凝效率，显微镜检发现壳聚糖基本不破坏单针藻细胞。本次实验壳聚糖的最低用量高于其他文献[14，17]，分析原因可能是藻种不同从而导致絮凝效率不同。对壳聚糖絮凝单针藻的实验条件进行优化，减少其用量，进而降低生产成本将是后续实验的研究重点。

在实验浓度范围内聚丙烯酰胺对单针藻细胞基本无絮凝作用。KAl（SO4）2和Ca（OH）2对单针藻絮凝效率较低，在实验浓度范围内随着絮凝剂用量增加絮凝效率增加，当絮凝剂用量为1.0g/L时，在实验测定时间内絮凝效率仅能达到70%；KA l（SO4）2对单针藻细胞损害较小，Ca（OH）2对单针藻细胞有较大的破坏。A l2（SO4）3、FeCl3、A lCl3絮凝效果较好，当用量分别为0.4、0.2、0.4g/L时，即能达到100%的絮凝效率，但过量的FeCl3、A lCl3反而不利于单针藻的絮凝；在实验浓度范围内，Al2（SO4）3、FeCl3对单针藻细胞损伤较小，高浓度的A lCl3（1.0g/L）会破坏单针藻细胞。

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