热带莫氏兰根提取物的抗氧化活性及稳定性研究

王呈文，纪明慧，陈光英，*，舒火明，2，*，孙崇格，林雪容

(1.海南师范大学“省部共建-热带药用植物化学”教育部重点实验，海南海口571158; 2.海南经贸职业技术学院，海南海口571127;3.三亚柏盈热带兰花产业有限公司，海南三亚572000)

莫氏兰(Mokara)为兰科莫氏兰属植物［1-2］，是一种新型热带兰花品种，具有茂盛的气生根。近年来，海南热带兰花莫氏兰发展很迅速，已成为海南农业发展的一个经济增长点。但是，主要集中在莫氏兰花的培育以及销售这两方面，缺乏对其根的化学成分及药理活性的研发，制约了莫氏兰产业的健康可持续的发展［3-4］。据文献报导，兰花中主要含有多糖、酚类、萜类、黄酮等化合物，这些化合物都有很强的清除羟基自由基的活性［5］，这引起了人们研究莫氏兰的广泛兴趣。本文采用超声提取法提取莫氏兰根中有效的抗氧化成分，考察其对羟基自由基(·OH)和DPPH自由基(DPPH·)的清除能力，为进一步开发利用莫氏兰提供有效的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莫氏兰根 均采于三亚柏盈热带兰花产业有限公司，自然晾干，粉碎到100～200目备用;芦丁标准品 中国药品生物制品检定所;DPPH· 美国Sigma-Aldrich公司;无水乙醇、过氧化氢、七水合硫酸亚铁、邻二氮菲、三羟甲基氨基甲烷、抗坏血酸(VC)、盐酸、氢氧化钠等 均为分析纯。

TP-214型电子天平 丹佛仪器北京有限公司; TU-1901型双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;RE-52A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;XO-5200DTS型超声波清洗仪 南京先欧仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 正交实验 参考文献［6-7］方法，通过预实验，得出乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取温度(D)、提取功率(E)为影响莫氏兰根提取物抗氧化活性的主要因素，因此设正交表L25(56)安排实验，采用超声波提取法对莫兰根抗氧化活性物质进行提取，以DPPH·的清除率为评价指标，考察最佳提取工艺。水平因素表见表1。

表1 水平因素表Table1 Level and factors of orthogonal test

1.2.2 提取物的抗氧化活性研究

1.2.2.1 抗氧化物质的提取 称取莫氏兰根粉末100.0g，按1.2.1最佳提取工艺条件提取抗氧化物质，在60℃减压浓缩至棕色浸膏10.0g，冷冻干燥，取1.0g提取物加无水乙醇溶解，定容至10m L容量瓶中配制成100mg/m L溶液。

1.2.2.2 提取物对·OH的清除作用 分别配制浓度为2、20、40、60、100、200、300μg/m L的莫氏兰根乙醇提取物溶液，考察其对·OH清除作用。参照文献［8-10］的方法进行测定。

1.2.2.3 提取物对DPPH·的清除作用 DPPH·是一种稳定的有机自由基，其溶液具有特征的紫红色吸收峰，当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的单电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。

反应体系中清除DPPH·的相对百分率，以VC为标准抗氧化剂与样品进行比较，作出清除率随浓度变化的曲线(以浓度为横坐标，清除DPPH·的百分率为纵坐标)，计算出对自由基清除率达50%的清除剂用量来评价其清除DPPH·的能力(即半抑制浓度，IC50)。

分别配制浓度为10、20、40、60、80、100、200、300、400μg/m L的莫氏兰根乙醇提取物溶液，考察其对DPPH·清除作用。样品对DPPH·的清除作用，参照文献［8-10］的方法进行测定。

1.2.3 提取物的稳定性研究

1.2.3.1 抗氧化活性保存率的计算 分别测定样品处理前还原力C0(μg/m L)和经各种处理后的还原力C1(μg/m L)，则其抗氧化活性保存率为［11］:

1.2.3.2 pH对莫氏兰根乙醇提取物抗氧化活性的影响 分别取5份浓度为60μg/m L的莫氏兰根乙醇提取物，用0.1mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液，调节其pH为2、4、6、8、10，并保存4h。测定其对DPPH·的清除能力［12-15］，并计算活性保存率。

1.2.3.3 温度对莫氏兰根乙醇提取物抗氧化活性的影响 取3份浓度为60μg/m L的莫氏兰根乙醇提取物溶液置于容量瓶中，分别在冰水浴锅，温度为:-10 (加入适量食盐)、0、20℃的条件下;以及取4份浓度为60μg/m L的莫氏兰根乙醇提取物溶液置于容量瓶中，分别在恒温水浴锅，温度为:30、40、60、80℃的条件下保持4h，测定其对DPPH·的清除能力［12-15］，并计算活性保存率。

1.2.3.4 光对莫氏兰根乙醇提取物抗氧化活性的影响 取3份浓度为60μg/m L的莫氏兰根乙醇提取物溶液置于容量瓶中，分别放置于自然光照下、白炽灯光照下、避光条件下，每隔一天测定其对DPPH·的清除能力，连续测7d［12-15］，并计算活性保存率。

2 结果与讨论

2.1 莫氏兰根乙醇提取物最佳提取工艺条件的筛选

以L25(56)安排实验，采用超声波提取法对莫兰根抗氧化活性物质进行提取，以DPPH·的清除率为评价指标，考察最佳提取工艺，结果见表2。

表2 正交实验结果Table2 Orthogonal experiment results

从表2中直观分析可以看出，乙醇浓度是影响提取物清除DPPH·活性的主要因素，因素影响的次序为:A＞D＞C＞B＞E，最佳的提取工艺条件为: A5B4C1D2E1，即无水乙醇，料液比为25mg:25m L，温度为50℃，提取时间为1h时，提取功率为48W时，提取物对DPPH·的清除效果最好，以此最佳提取工艺条件进行3次验证实验，其对DPPH·的平均清除率可达到92.00%。

2.2 提取物的抗氧化活性研究

2.2.1 莫氏兰根乙醇提取物对·OH的清除能力 由图1可知，莫氏兰根乙醇提取物对·OH有一定的清除能力，随着浓度的增加，清除率也增加，浓度与清除率有一定的量效关系，莫氏兰根乙醇提取物清除·OH的IC50=45.20μg/m L，同时测定了VC对·OH的清除能力，其IC50=104.75μg/m L，莫氏兰根乙醇提取物对·OH的清除能力大于VC对·OH的清除能力。

图1 清除羟基自由基的能力Fig.1 Effects of scavenging hydroxyl radical

2.2.2 莫氏兰根乙醇提取物对DPPH· 的清除能力 由图2可知，莫氏兰根乙醇提取物对DPPH·有一定的清除能力，随着浓度的增加，清除率也增加，存在一定的量效关系，其IC50=34.62μg/m L。同时测定了VC对DPPH·的清除能力，其IC50=72.40μg/m L。因此，莫氏兰根乙醇提取物对DPPH·的清除能力大于VC对DPPH·的清除能力。

2.3 抗氧化稳定性

2.3.1 pH对莫氏兰根乙醇提取物抗氧化活性的影响

由表3可知，莫氏兰根乙醇提取物的抗氧化活性成分在碱性条件下能稳定存在，活性保持率在98%以上，但在酸性环境中，抗氧化成分不稳定，对DPPH·清除的活性降低，在pH为2时，活性降低了38.27%。

2.3.2 温度对莫氏兰根乙醇提取物抗氧化活性的影响 由表4可知，当温度在-10～40℃时，莫氏兰根乙醇提取物的抗氧化活性成分较稳定，对DPPH·的清除率基本不变，活性保持率在99%以上。当温度升到80℃时提取物对DPPH·的清除率有下降的趋势，但变化不大，活性保持率为86.68%，因此，莫氏兰根乙醇提取物有较高的热稳定性。

图2 对DPPH·的清除能力Fig.2 Effects of scavenging DPPH free radical

表3 pH对莫氏兰根乙醇提取物清除DPPH·的活性影响Table3 Effect of pH value on DPPH radical scavenging of the ERM

表4 温度对莫氏兰根乙醇提取物清除DPPH·的活性影响Table4 Effect of temperature on DPPH radical scavenging of ERM

表5 光对莫氏兰根乙醇提取物清除DPPH·的活性影响Table5 Effect of light on DPPH radical scavenging of ERM

2.3.3 光对莫氏兰根乙醇提取物抗氧化活性的影响 不同光照环境下，莫氏兰根乙醇提取物对DPPH·的清除作用结果见表5，从表中可以看出，白炽灯照对莫氏兰根乙醇提取物抗氧化活性影响较大，白炽灯照到7d时，活性保持率为57.67%。在自然光照和避光条件下，莫氏兰根对DPPH·的清除率随时间的延长呈下降趋势，但在前4d时间里，活性保持率都在80%以上，故莫氏兰根乙醇提取物对自然光有一定的稳定性。

3 结论

莫氏兰根乙醇提取物的最佳的抗氧化活性提取工艺条件为:无水乙醇，料液比为25mg:25m L，温度为50℃，提取时间为1h，功率为48W时，提取物抗氧化活性最好，对DPPH·的清除率可达到92.00%。提取物清除·OH的IC50为45.20μg/m L，清除DPPH·的IC50为34.62μg/m L，有较高的耐热性和一定光稳定性，且在碱性条件下提取物抗氧化活性较稳定。

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