鲢鱼内脏油提取方法的比较研究

王海磊，罗庆华，*，黄美娥，王苗苗，吴沛霖，向建国

（1.吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室，湖南张家界427000；2.湖南食品药品职业学院，湖南长沙410208；3.中南民族大学生命科学学院，湖北武汉430074；4.湖南农业大学动物科技学院，湖南长沙410128）

鲢鱼（Hypophthalmichehys molitrix）是我国淡水养殖的“四大家鱼”之一，鲢鱼以浮游动植物为食，食物链短，是水环境中能量转化效率最高的鱼类之一。鲢鱼生长快，天然产量高，价格便宜，分布广泛，我国各大水系随处可见[1]。鲢鱼腹腔内含有大量脂肪，与其他淡水鱼相比，其脂肪中含有较高的二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等多烯酸，n-3族多烯酸总含量达到34.9%，ω-3与ω-6的比值约为1.7，远高于其他淡水鱼，与海水鱼相近[2]。研究从鲢鱼加工废弃物—内脏中提取鱼油，变废为宝，具有重要的经济效益与生态效益。

目前，鱼油的提取方法主要有压榨法[3]、有机溶剂法[4]、蒸煮法[5]、淡碱水解法[6]、酶解法[7]和超临界流体萃取法[8]等，经过改进的淡碱水解法—钾法，提取液中含有钾盐，可以进一步生产为钾肥，应用于农业生产[9]。酶解法提取鱼油的工艺条件温和，提取率高，鱼油质量好，同时酶解液中还含有丰富的小分子肽和氨基酸等，可以进一步加以利用[10]。本研究以鲢鱼内脏为原料，采用钾法和酶解法进行鱼油提取工艺条件对比研究，并结合鱼油理化分析指标，获得最佳鱼油提取方法与工艺条件，以期为鲢鱼及其他淡水鱼内脏的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲢鱼 秋季购自湖南省张家界市永定区农贸市场，2～3龄，体重1.5～3.0kg；先将其内脏去除胆囊、鳔及肠道内消化物，清洗沥干，用绞肉机绞碎，-20℃冷冻储藏备用；石油醚（30～60℃）、氢氧化钾、硝酸钾、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、冰乙酸、异辛烷、碘化钾、硫代硫酸钠、环己烷、淀粉、韦氏试剂、正己烷 均为分析纯；碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 均为食品级，20万U/g，南宁庞博生物工程有限公司。

HH-系列恒温水浴锅 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂；JA2003N型分析天平 上海佑科仪器仪表有限公司；HM-20S型pH计日本东亚电波工业株式会社；LD5-2A型离心机 北京医用离心机厂；

1.2 实验方法

1.2.1 鲢鱼内脏粗脂肪含量测定 索氏抽提法，参照GB/T 5009.6-2003。

1.2.2 鱼油提取率的计算 鱼油提取率（%）=鱼油质量/原料中的脂肪质量×100。

1.2.3 钾法提取鱼油工艺 称取20g（精确至0.001g）样品于250m L锥形瓶中，按液固比1.5∶1（m L/g）加水，用20%氢氧化钾溶液调pH后置于水浴中，搅拌加热到一定温度，保温一定时间，加入一定量的硝酸钾，继续搅拌保温一定时间，然后在4500r/min下离心15m in，分离出上层油脂，得粗鱼油提取率。

1.2.3.1 不同pH对鱼油提取率的影响 分别调pH 6、7、8、9、10后，于70℃、水解40m in，再加入4%KNO3，盐析20min，提取鱼油进行分析。

1.2.3.2 不同水解温度对鱼油提取率的影响 调整pH为8后，分别于50、60、70、80、90℃，水解40m in，再加入4%KNO3，盐析20m in，提取鱼油进行分析。

1.2.3.3 不同水解时间对鱼油提取率的影响 调整pH为8，于70℃，分别水解30、40、50、60、70m in后，再加入4%KNO3，盐析20m in，提取鱼油进行分析。

1.2.3.4 不同盐用量对对鱼油提取率的影响 调整pH为8，于70℃，水解40min后，再分别加入2%、3%、4%、5%、6%KNO3，盐析20m in，提取鱼油进行分析。

1.2.3.5 不同盐析时间对鱼油提取率的影响 调整pH为8，于70℃，水解40m in后，加入5%KNO3，再分别盐析10、20、30、40、50m in，提取鱼油进行分析。

1.2.3.6 正交实验 根据单因素实验结果，在液固比1.5∶1、KNO3用量5%的条件下，选择温度、pH、水解时间、盐析时间4个因素作为正交实验因素，以鱼油的提取率为指标，采用L9（34）正交实验设计，因素水平见表1。

表1 钾法提取鱼油的正交实验因素及水平表Table1 Factors and levels of potassium hyelroxide hydrolysis of orthogonal test

1.2.4 酶解法提取鱼油工艺 称取20g（精确至0.001g）样品置于250m L锥形瓶中，按液固比1∶1加水后调节pH至蛋白酶最适值，然后加入一定量的蛋白酶，于一定温度条件下保温水解一定时间。酶解完成后，倒出酶解液，用适量水冲洗锥形瓶，溶液并入酶解液，酶解液在4500r/m in下离心15m in，分离出上层油脂，得粗鱼油。

1.2.4.1 酶的筛选 在酶添加量2%，液固比为1∶1，在各种酶的最适条件下酶解4h，提取鱼油进行分析。

1.2.4.2 不同pH对鱼油提取率的影响 调液固比1∶1，调pH 5、6、7、8、9后，加入2%木瓜蛋白酶，于50℃、酶解4h，提取鱼油进行分析。

1.2.4.3 不同酶解温度对鱼油提取率的影响 调液固比1∶1、pH 7后，加入2%木瓜蛋白酶，分别于30、40、50、60、70℃条件下，酶解4h，提取鱼油进行分析。

1.2.4.4 不同酶添加量对鱼油提取率的影响 调液固比1∶1、pH 7后，分别加入1%、2%、3%、4%、5%木瓜蛋白酶后，于50℃条件下，酶解4h，提取鱼油进行分析。

1.2.4.5 不同酶解时间对鱼油提取率的影响 调液固比1∶1、pH 7后，加入2%木瓜蛋白酶后，于50℃条件下，分别酶解1、2、3、4、5h，提取鱼油进行分析。

1.2.4.6 不同液固比对鱼油提取率的影响 分别以液固比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1加水后，调pH7后，加入2%木瓜蛋白酶，于50℃条件下，酶解3h，提取鱼油进行分析。

1.2.4.7 正交实验 根据单因素实验结果，在pH为7的条件下，选择温度、酶解时间、酶添加量和液固比4个因素作为正交实验因素，以鱼油的提取率为指标，采用L9（34）正交实验设计，因素水平见表2。

表2 酶法提取鱼油的正交实验因素及水平表Table2 Factors and levels of enzymolysis hydrolysis orthogonal test

1.2.5 鱼油的理化性质分析 酸值：热乙醇测定法（GB/T 5530-2005）；过氧化值：硫代硫酸钠滴定法（GB/T 5538-2005）；碘值：硫代硫酸钠滴定法（GB/T 5532-2008）；水分及挥发物含量测定：直接干燥法（GB/T 5528-2008）；不溶性杂质：坩埚式过滤器法（GB/T 15688-2008）。

1.2.6 数据处理 运用SPSS 20.0软件进行数据处理，每个实验重复三次，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 脂肪含量

测得鲢鱼内脏的脂肪含量为36.21%，比相关报道[11]的含量高，这可能与鲢鱼的饲养方式和取鱼季节有关。

2.2 钾法提取鲢鱼内脏鱼油

2.2.1 pH对提取率的影响 由图1可知，随着pH的升高，鱼油提取率先增加后减小，pH为8时鱼油的提取率最高。

图1 pH对鱼油提取率的影响Fig.1 Effectof pH on the extraction rate of fish oil

2.2.2 水解温度对提取率的影响 由图2可知，随着提取温度的升高，鱼油提取率先增大后减小，70℃时鱼油的提取率最高。

图2 温度对鱼油提取率的影响Fig.2 Effectof temperature on the extraction rate of fish oil

2.2.3 水解时间对提取率的影响 由图3可知，在40min之前，鱼油提取率随着水解时间的延长而急剧增大，40m in之后，提取率略有增大，随着时间的延长，鱼油的氧化程度较深，品质下降。因此最适水解时间为40m in。

2.2.4 盐用量对提取率的影响 由图4可知，鱼油提取率随着硝酸钾用量的增加，先增加后减小，当KNO3用量为5%时提取率达到最大。

图3 水解时间对鱼油提取率的影响Fig.3 Effectof hydrolysis time on the extraction rate of fish oil

图4 硝酸钾用量对鱼油提取率的影响Fig.4 Effectof potassium nitrate amounton the extraction rate of fish oil

2.2.5 盐析时间对提取率的影响 由图5可知，鱼油提取率随着盐析时间的增加，先增大后减小，当盐析时间为20min时达最高值。

图5 盐析时间对鱼油提取率的影响Fig.5 Effect of salting out time on the extraction rate of fish oil

2.2.6 正交实验结果与分析 对表3中数据进行方差分析，其结果由表4可知，因素A、B较显著，因素C显著，因素D不显著，因素作用的顺序是B＞A＞C＞D，即pH＞水解温度＞水解时间＞盐析时间，与极差分析得出的结果一致。分析得出钾法提取鲢鱼内脏鱼油的最佳工艺条件为A2B1C2D1，即液固比1.5∶1、硝酸钾用量5%、温度70℃、pH 7.5、水解时间40m in和盐析时间15min。验证实验结果为87.49%，高于正交实验表中其他组合结果，表明该条件下鱼油提取率最高。

表3 正交实验结果与分析Table3 Results and analysis of orthogonal test

表4 正交实验结果方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal test

2.3 酶解法提取鲢鱼内脏油

2.3.1 酶的筛选 由表5可知，木瓜蛋白酶的提取率最高。这可能与蛋白酶的酶切位点及对肽键的专一性不同有关。采用木瓜蛋白酶进行鱼油的提取。

表5 不同种类的酶对鱼油提取率的影响Table5 Effectof enzyme on the extraction rate of fish oil

2.3.2 pH对提取率的影响 由图6可知，鱼油提取率随着pH的升高，先增大后减小，当pH为7时鱼油提取率最高。各种蛋白酶在具有特定的最适pH，过高或过低的pH都会影响酶的活力。

2.3.3 酶解温度对提取率的影响 由图7可知，鱼油提取率随酶解温度的升高，先增大后减小，温度为50℃时，鱼油提取率最高。

2.3.4 酶添加量对提取率的影响 由图8可知，随着酶添加量的增大，鱼油提取率先增大后减小，酶适宜添加量为2%。

图6 pH对鱼油提取率的影响Fig.6 Effect of pH value on the extraction rate of fish oil

图7 酶解温度对鱼油提取率的影响Fig.7 Effectof enzymolysis temperature on the extraction rate of fish oil

图8 酶添加量对鱼油提取率的影响Fig.8 Effectof enzyme dosage on the extraction rate of fish oil

图9 酶解时间对鱼油提取率的影响Fig.9 Effectof enzymolysis time on the extraction rate of fish oil

2.3.5 酶解时间对提取率的影响 由图9可知，在3h之前，鱼油提取率随着时间的增加急剧上升，当时间超过3h后，提取率稍有增大。但考虑到随着时间的延长，鱼油的氧化程度加深，品质下降。因此最佳酶解时间为3h。

2.3.6 液固比对鱼油提取率的影响 由图10可知，随着液固比的增加，鱼油提取率先增加后减小，当液固比为2∶1时，鱼油提取率达到最大值。

图10 液固比对鱼油提取率的影响Fig.1 0 Effectofwater-to-material ratio on the extraction rate of fish oil

表6 正交实验结果与分析Table6 Results and analysis of orthogonal test

2.3.7 正交实验结果与分析 对表6中数据进行方差分析，其结果见表7，可见，因素A、C、D显著，因素B不显著，因素作用的主次顺序是A＞D＞C＞B，即酶解温度＞液固比＞酶添加量＞酶解时间，与极差分析结果一致。由k值显示，最优组合条件为A2B3C1D1。由于因素B（酶解时间）影响不显著，为了节省时间，并减少由于酶解时间的延长而导致鱼油氧化程度加深，确定酶解法的最佳工艺条件为A2B1C1D1，即温度50℃、酶解时间2.5h、酶添加量1.5%和液固比1.5∶1。验证实验结果为90.33%，高于正交实验表中其他组合的结果，表明该条件下鱼油提取率最高。

表7 正交实验结果方差分析Table7 Variance analysis of orthogonal test

2.4 鱼油的理化性质分析

粗鱼油理化性质分析结果见表8。可见，两种方法提取的鱼油均达到粗鱼油二级标准，其中过氧化值均达到粗鱼油一级标准。酶解法提取的鱼油品质稍好。这可能与提取温度有关，因酶解法比钾法提取温度低，操作条件温和，鱼油氧化程度低。但粗鱼油因含有水分、磷脂、粘液质、蛋白质、游离脂肪酸和色素等杂质，其品质较差且不稳定，需要经过进一步的精制，提高鱼油的品质。

3 结论

3.1 鲢鱼内脏脂肪含量高，为36.21%，鱼油提取率高，钾法与酶解法的提取率分别达87.49%与90.33%，故其为鱼油提取的良好材料。利用鲢鱼内脏生产鱼油可以突破深海鱼油原料的局限，并能提高鲢鱼的产品附加值和资源利用率，同时可避免环境污染，具有重要的经济和生态效益。

3.2 钾法提取鲢鱼内脏油的最佳工艺条件为液固比1.5∶1、硝酸钾用量5%、温度70℃、pH 7.5、水解时间40m in和盐析时间15m in，鱼油提取率为87.49%。酶解法提取鲢鱼内脏油的最佳工艺条件为pH 7、温度50℃、酶解时间2.5h、酶添加量1.5%和液固比1.5∶1，鱼油提取率为90.33%。酶解法的提取率高于钾法，且提取的鱼油品质稍好于钾法，酶解法是鲢鱼油提取的较好方法。

表8 粗鱼油的理化性质Table8 Physics and chemistry indexes of crude fish oil

3.3 两种方法最佳工艺条件下提取的鱼油均达到粗鱼油的二级标准，其中过氧化值均达到粗鱼油一级标准。需进行精制以达到食用的目的。

[1]王金余，刘承初，赵善贞，等.白鲢鱼糜肌球蛋白交联反应和凝胶化最适条件的研究[J].食品科学，2008（11）：223-227.

[2]姚婷.海水鱼与淡水鱼ω-3多不饱和脂肪酸含量的比较研究[J].现代食品科技，2005，21（3）：26-29.

[3]吴时敏.功能性油脂[M].北京：中国轻工业出版社，2004：145-146.

[4]刘淑君，娄永江.鱼粉中鱼油浸提的工艺优化研究[J].食品工业科技，2013，34（2）：266-268，272.

[5]Sathivel S，Yin H，PrinyawiwatkulW，et al.Comparisons of chemical and physical properties of catfish oils prepared from different extracting processes[J].Journal of Food Science，2009，74（2）：E70-E76.

[6]刘政坤，杨小克，江晓路，等.鱿鱼内脏油的提取研究[J].中国油脂，2011，36（9）：9-13.

[7]周长平，孙军涛，王洪新，等.酶解法提取南极磷虾虾油的研究[J].中国油脂，2013，38（3）：1-5.

[8]Rodriguez N R，Diego SM，Beltran S，et al.Supercritical fluid extraction of fish oil from fish by-products：A comparison with othermethods[J].Food Engineering，2012（109）：238-248.

[9]杨官娥，杨琦，赵建滨，等.钾法提取鱼油的工艺研究[J].山西医科大学学报，2001，32（1）：31-32.

[10]石迪，郝剑君，杨小克，等.微碱条件生物酶法提取鱿鱼油工艺研究[J].食品工业科技，2012，33（2）：277-281.

[11]唐峰.鲢鱼内脏综合利用的工艺研究[D].无锡：江南大学，2008.