高效液相色谱法快速检测食品中18种合成色素

吴彦蕾，林晓洋，胡 靖，赵 博，朱永红，*

（1.重庆市计量质量检测研究院食品质量监督检验研究中心，国家农副加工产品及调味品质量监督检验中心，重庆市食品安全工程技术研究中心，重庆401123；2.重庆科技学院化学化工学院，重庆401331）

合成色素是采用化学合成的方法制备，大多是以苯、甲苯、萘等化工产品为原料，经过磺化、硝化、卤化、偶氮化等一系列反应合成而来，但由于成本低，着色力强，色泽鲜艳等特点被广泛使用于食品加工生产过程中[1]。当前食品中滥用合成色素的现象较为普遍，对食品中合成色素（包括食用合成色素和非食用合成色素）的检测已成为各级食品检验机构日常检验工作的重要内容。由于食品中可能添加的合成色素种类较多，现有的检测方法标准已不能满足实际检测工作的需要。如国家标准方法《食品中合成着色剂的测定》[2]仅对柠檬黄、苋菜红、日落黄等8种人工合成着色剂进行了测定，而且该方法前处理步骤较为繁琐，用聚酰胺粉净化虽然会排除一些干扰峰，但在很大程度上会造成目标物质的损失，且处理方法耗时长，不利于大批样品的快速筛查；国家标准方法《食品中禁用物质的检测-碱性橙染料》[3]仅对碱性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22进行检测；行业标准《进出口食品中罗丹明B的检测方法》[4]仅对食品中的罗丹明B进行检测；地方标准《食品和农产品中多种碱性工业染料的测定》[5]仅对碱性橙、碱性嫩黄O及罗丹明B进行检测等。因此，要同时开展多种合成色素的检测，需要采用不同方法标准。

近年来，针对合成色素的高通量检测方法已有较多报道[6-11]，但这些方法大多采用色谱质谱联用技术，且涉及的色素种类过多，并不太适合在日常检测工作中使用。为了提高样品分析有效性及针对性，本实验将食品中常见的食用和非食用合成色素作为研究对象，通过对现有方法进行改进，建立一种采用HPLC法同时检测食品中18种水溶性合成色素的方法，并对市场上部分有色食品进行了快速检测，取得满意结果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品 购自于重庆市区超市、零售摊点及菜市场；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯） 购自美国TEDIA试剂公司；乙酸铵（分析纯）、乙酸铅（分析纯） 购自成都市科龙化工试剂厂；柠檬黄（0.500mg/m L）、日落黄（0.500mg/m L）、苋菜红（0.500mg/m L）、胭脂红（0.500mg/m L）、亮蓝（0.500mg/m L）、赤藓红（100mg/L）、诱惑红（100mg/L） 购自国家标准物质中心；靛蓝、罗丹明B、专利蓝 购自Dr.Ehrenstorfer公司；碱性橙21、碱性嫩黄O、皂黄、碱性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ 购自Sigma A ldrich公司；喹啉黄、碱性橙22、偶氮玉红 购自TCI公司。

戴安Ultimate 3000型高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器）、AL204电子天平（感量为0.0001g）梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司；VORTEX GENIUS3型旋涡混合仪 德国IKA；SB-5200DT型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅 江苏省余杭市荣华仪器制造有限公司；CF12RXⅡ型高速冷冻离心机日本HITACH I；Prouv型超低有机型纯水器 德国Sartorius stedim。

1.2 标准溶液的制备

将18种色素用20%的甲醇溶液配制成质量浓度均为100mg/L的混合标准储备液，储存于4℃冰箱。将混合标准储备液用20%甲醇依次稀释成0.5、1.0、2.0、 5.0、10.0、20.0mg/L的标准系列溶液，现用现配。

1.3 高效液相色谱条件

色谱柱：Venusil MPC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：A为甲醇∶乙腈（1∶1），B为0.02mol/ L乙酸铵溶液；流速：1.0m L/m in；梯度洗脱程序：0～12.0min，5%A；12.0～30.0min，5%～35%A；30.0～35.0min，35%～98%A；35.0～35.1m in，98%～5%A；35.1～55m in；5%A。检测器：二极管阵列检测器，扫描范围：200～800nm；进样量：10μL。各对照品的检测波长；柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、罗丹明B：254nm，喹啉黄、皂黄、碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O：400nm，诱惑红、偶氮玉红、赤藓红、酸性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22：500nm，亮蓝、专利蓝：600nm。

1.4 样品处理方法

1.4.1 果汁、饮料 称取5g（精确到0.01g）样品，置于25m L比色管中（含二氧化碳的样品在水浴锅上加热驱除二氧化碳），用20%的甲醇溶液定容至25m L。

1.4.2 糖果、酱腌菜类 称取5g（精确到0.01g）样品，置25m L比色管中，加入20%的甲醇溶液浸泡，置于水浴锅中加热，使其中色素充分溶解，最后用20%的甲醇溶液定容至25m L。

1.4.3 素食、糕点类 称取5g（精确到0.01g）样品，置25m L比色管中，加入20%的甲醇溶液浸泡，超声30m in，使其中的色素充分溶解，最后用20%的甲醇溶液定容至25m L。

1.4.4 冰淇淋、牛奶类 称取5g（精确到0.01g）样品，置25m L比色管中，加入2m L左右的乙酸铅溶液（22mg/m L），使其中的蛋白质沉淀，静置30m in，最后用20%的甲醇溶液定容至25m L。

取上清液转入10m L离心管中，以10000r/m in离心5m in，用0.45μm聚四氟乙烯（PTFE）微孔滤膜过滤后供HPLC测定。

2 结果与讨论

2.1 合成色素检测对象及分析方法的选择

合成色素的种类众多，为了提高检测效率，建立一种能同时检测多种合成色素的方法非常必要。如前所述，近年来针对合成色素的高通量检测方法已有较多报道[6-11]。而这些方法中涉及的许多色素种类并未在食品中检出过，而且这些方法大多采用了色谱-质谱联用分析方法，并不太适合在日常检测工作中使用。本研究以食品中常见的合成色素作为检测对象，以提高检测的针对性，这些色素包括常见的食用合成色素和一些方法标准中所涉及的非食用合成色素。对于检测方法，选择基于紫外可见光检测器的HPLC法，这也是目前食品检测机构最常用的食品中合成色素的检测方法。

2.2 色谱条件的选择

国家标准方法GB/T 5009.35中采用的流动相为0.02mol/L乙酸铵溶液与甲醇，本研究为了提高流动相对18种色素的洗脱能力，达到快速、有效分离，参考文献[6]方法，将甲醇改进为甲醇∶乙腈（1∶1）进行梯度洗脱，最佳洗脱模式如1.3所述。各组分经过C18色谱柱分离后，由二极管阵列检测器扫描得紫外吸收光谱，各组分的最大吸收波长分为为：柠檬黄（258、427nm）、苋菜红（216、520nm）、靛蓝（288、600nm）、胭脂红（215、509nm）、日落黄（236、480nm）、罗丹明B（259、547nm）、喹啉黄（414、432nm）、皂黄（417nm）、碱性橙Ⅱ（403nm）、碱性嫩黄O（435nm）、诱惑红（508nm）、偶氮玉红（518nm）、赤藓红（530nm）、酸性橙Ⅱ（484nm）、碱性橙21（489nm）、碱性橙22（494nm）、亮蓝（628nm）、专利蓝（634nm）。因此，确定18种组分的定量波长为：柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、罗丹明B在254nm处同时检测，喹啉黄、皂黄、碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O在400nm处同时检测，诱惑红、偶氮玉红、赤藓红、酸性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22在500nm处同时检测，亮蓝、专利蓝在600nm处同时检测。在优化的条件下各组分得到了有效分离，图1为18种色素的标准色谱图。

2.3 提取方法的确定

分别用纯水、甲醇-水（2∶8）作为提取液，结果发现，以纯水提取样品中色素时，碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O、偶氮玉红、酸性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22这类保留时间较长的色素回收率较低，尤其是碱性橙22，空白样品的加标回收率仅为10%～20%。当在提取液中加入20%的甲醇时，样品中的色素提取较完全，能够得到较为理想的加标回收率（结果见表1）。此外，我们发现，微孔滤膜对回收率有较大影响。霍艳敏等[12]发现混合纤维素膜对赤藓红有较强吸附，样品采用离心代替过滤，但对一些粘性较强的样品，仅靠离心尚不足以对提取液进行有效地澄清，因此采取离心后过微孔滤膜的方式。观察发现，常用的聚醚砜和尼龙滤膜对部分色素也有很强的吸附作用，其中赤藓红的加标回收率仅为5%左右。本研究最后采取0.45μm PTFE滤膜过滤，取得较好的效果，这与文献[11]报道一致。

2.4 线性范围与检出限

分别配制浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0mg/L的色素混合标准溶液，按照优化的检测条件进样分析，以峰面积Y对相应的浓度X进行线性回归，检出限以3倍信噪比计算。各色素的线性回归方程、相关系数及方法检出限见表2。结果表明，18种色素在0.5～20.0mg/L范围内具有良好的线性。相关系数r均大于0.9980，检出限在0.06～3.75mg/kg之间。

2.5 回收率与精密度

在空白饮料样品中分别添加各色素含量分别为3、15、40mg/kg三个水平的标样，按实验方法测定，外标法定量，平行测定6次，回收率及相对标准偏差见表1。结果显示，色素添加量为3、15、40mg/kg时，18种色素的加标回收率为68.9%～100.8%，相对标准偏差（RSD）为0.1%～5.3%，表明该方法精密度良好。

2.6 实际样品分析

在优化的条件下对目前重庆市场上的部分有色食品开展了快速筛查工作，样品主要涉及果汁、饮料、糖果、酱腌菜、凉拌菜、冰淇淋等几类。筛查结果显示，目前市场上的有色食品中添加合成色素较为常见，所添加的色素均为食用色素，暂未发现非食用色素的非法添加行为。检测发现，摊位零售的散装果汁饮料（如西瓜汁、蓝莓汁、芒果汁等）以及糖果类大多含有食用合成色素，包括柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝等6种。按照GB2760-2011《食品添加剂使用标准》对这几种色素的限量规定，均未超标。购自超市的榨菜和菜市场的散装即食凉拌海白菜检出柠檬黄超出0.1g/kg的限量值。此外，在少数呈现明显绿色的即食凉拌萝卜干和海白菜中检出柠檬黄和亮蓝。

图1 18种合成色素的标准色谱图Fig.1 The standard chromatograms of 18 synthetic colors

3 结论

本文采用HPLC法建立了对18种常见食用色素与非食用色素的同时检测方法，采用快速、简便、通用的前处理方法与色谱条件，得到满意的结果，适用于大批量样品中多种食用色素和非食用色素的快速筛查，可为食品安全风险监测工作提供技术支持。

表1 空白饮料样品中18种色素加标回收率及相对标准偏差Table1 Spiked recoveries and RSDs of 18 synthetic colours in blank samples

表2 18种色素的线性方程、相关系数与检出限Table2 Linear equations and detection limits（LOD）of 18 synthetic colors

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