新生仔猪急性腹泻疫情中5种病毒感染的分子检测

■常洪涛 杜季梅 陈 陆 赵 军 郭占达 王川庆

（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州，450002）

猪腹泻性疫病是指以感染猪只发生呕吐、腹泻、快速脱水及高死亡率为主要特征的一类疾病，其病因极其复杂，即许多因素如管理、饲料、猪生理特性和病原微生物感染等均可引起，但以猪流行性腹泻（PED）、猪传染性胃肠炎（TGE）、猪轮状病毒（GAR）、猪伪狂犬病（PR）和猪瘟（SCF）5种病毒性疫病最为普遍和严重[1-3]。2010年11月至今，新生仔猪急性腹泻疫情在全国范围内大爆发，主要感染1周龄以内（尤其是2～3 d）的初生仔猪，发病率高达90%以上，死亡率几乎为100%，同时具有发病急、传播速度极快、反复发作及药物完全无效等特征。种猪、保育猪和育肥猪多呈一过性感染，一般一周内可自行康复，但产房母猪感染后会造成泌乳量减少，乳汁稀薄，品质下降。河南省是养猪大省，年出栏量多年稳居全国前列，也是此次疫情发生和流行最为严重的省份之一，经济损失惨重。为查明河南省新生仔猪急性腹泻疫情的主要病因，本研究分别应用RT-PCR和PCR方法对上述5种猪主要腹泻性疫病的病原感染进行了分子检测，从而为其有效诊断和综合防治提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

待检样品为2012年河南省豫东地区、豫南地区、豫西地区和豫北地区98个猪场送检的发病仔猪的肠道、淋巴结、脾脏、三叉神经和脑等疑似病料，冻存待用。

1.2 参考毒株

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（GARV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）等参考毒株由本实验室提供。

1.3 主要试剂和仪器

DNA提取试剂盒由北京百泰克公司提供；RNA提取用TRIZOL LS Reagent购自Invitrogen公司；TaqD⁃NA聚合酶、M-MLV反转录酶、DL2000 Marker等购自宝生物工程(大连)有限公司；组织捣碎仪、生物安全柜、PCR扩增仪和高速冷冻离心机为Thermo公司产品；倒置生物显微镜为olympus公司产品；Alpha Innotech凝胶成像仪为美国Alpha公司产品，DYC3113型电泳槽为北京六一仪器厂产品。

1.4 引物设计

根据GenBank收录的PEDV ORF3基因序列、TGEV N基因序列、GARV VP6基因序列、CSFV E2基因序列、PRV gE基因序列应用Primer Premier 5.0软件分别设计5对引物，各引物序列详见表1。引物合成由上海生工生物工程公司完成。

表1 用于检测5种病毒性疫病的PCR引物

1.5 病料处理和DNA、RNA提取

用PBS缓冲液将各病料5倍稀释，在无菌操作台上去除筋腱等结缔组织，使用小型组织捣碎仪将其制成匀浆，反复冻融3次，以4℃、8 000 r/min离心5 min取上清液，按TRIZOL操作步骤和DNA提取试剂盒使用说明书，分别提取病料总RNA和DNA。并应用所设计的PEDV、TGEV、GARV和CSFV下游引物对提取的RNA进行反转录，其cD⁃NA和PRV的DNA于-20℃保存待用。

1.6 PCR检测

PEDV、TGEV、GARV、CSFV和PRV的PCR反应各体系及反应参数详见表2、表3。

表2 PEDV、TGEV、GARV、CSFV和PRV的PCR各反应体系

表3 PEDV、TGEV、GARV、CSFV、PRV的 PCR各循环参数

2 结果与分析

2.1 样品检测结果

利用所设计的PEDV、TGEV、GARV、CSFV和PRV引物，应用RT-PCR技术和PCR技术分别扩增出长度约为964、528、1 194、276、808 bp的基因片段，得到与预期目的片段大小一致的扩增产物，结果见图1～图5。

图2 部分样品TGEVV检测结果

图3 部分样品TGEV检测结果

图4 部分样品CSFV检测结果

图5 部分样品PRV检测结果

2.2 河南省猪场腹泻病原分子检测结果（见表4）

由表4可知，送检的181份被检样品中，PEDV阳性样品数为129份，阳性检出率高达71.27%，与TGEV、GARV、CSFV和PRV的混合感染阳性样品数分别为5份、4份、103份和31份，阳性检出率分别为2.76%、2.21%、56.91%和17.13%，与TGEV和GARV的三重混合感染阳性样品数为1份，阳性检出率仅为0.55%，而与CSFV和PRV的三重混合感染阳性样品数为31份，阳性检出率为17.10%；TGEV、GARV、CSFV和PRV的阳性样品数分别为10份、4份、125份和80份，阳性检出率分别为5.52%、2.21%、69.06%和44.20%；CSFV和PRV的混合感染阳性样品数为58份，阳性检出率为32.04%。

2.3 腹泻病原检测阳性猪场在不同地区、不同季节和不同规模猪场的分布结果（见表5）

由表5可知，98个发病送检猪场中均检测出猪腹泻性疫病病原呈阳性，其中豫东、豫南和豫北地区等养猪较为密集地区的阳性场数分别为28个、31个和32个，所占比例分别为28.57%、31.63%和32.65%，分布较为均匀；在季节分布上，以冬季所占比例最多，为42.86%，其次为秋季和春季，分别为24.49%和17.35%，夏季最低，为15.31%；规模化猪场为64个，占65.31%，中小型猪场为34个，占34.69%。

表4 河南省猪场腹泻性病原分子检测结果

表5 检测阳性猪场在不同地区、不同季节和不同规模的分布结果

3 讨论

自2010年冬季至今，新生仔猪急性腹泻在全国范围内广泛流行，已成为猪场常发传染病之一，是当前造成新生仔猪高死亡率的最主要原因，且疫情有逐步扩大和日趋加重之势，控制效果极不理想。其根本原因在于引起猪腹泻表现的病原体在流行病学、临床症状、剖检变化上非常相似，且多为并发感染或者混合感染，给临床诊断带来极大困难，也无法采取针对性的有效措施。因此，开展对新生仔猪急性腹泻疫情中主要病原感染的分子检测，探明引起此次疫情的真正病因，具有重要的现实意义。

本研究对河南省98家猪场送检的具有腹泻表现的仔猪病料较为全面系统地进行了PEDV、TGEV、GARV、CSFV和PRV的分子检测，结果显示，PEDV阳性检出率高达71.27%，是引起此次疫情的最主要病因。值得注意的是，这些猪场多数都曾接种过TGE-PED二联灭活疫苗，但并未使免疫猪群获得有效保护，我们分析一方面是由于当前PEDV流行毒株S基因（PEDV主要免疫原性基因）比疫苗毒株CV777在S1区部分部位分别插入15个碱基和缺失6个碱基，已发生较大变异；二是由于PEDV免疫是以局部黏膜免疫为主，一般认为只有弱毒活苗才能在乳腺等局部产生可有效抵抗PEDV感染的sI⁃gA，但我国目前并未批准活苗推广使用[4-6]，而经肌肉注射或后海穴注射的灭活疫苗其抗体类型主要是IgG[7]，并不能产生确切的免疫效果。因此，研发针对PEDV流行毒株的新型疫苗迫在眉睫。而TGEV的检测阳性率为5.52%，与PEDV的混合感染率也仅为2.76%，这和PEDV多与TGEV混合感染的传统理论并不相符，主要原因在于目前TGEV流行毒株并未发生较大变异，现有疫苗可对其产生有效保护有关。

我国拥有世界上最优秀的猪瘟兔化弱毒疫苗[8]，猪伪狂犬基因缺失疫苗配合鉴别诊断试剂盒的方案经多年推广使用也已使该病逐步趋于净化[9-10]，但本研究中CSFV和PRV的阳性检出率分别高达69.06%和44.20%，PEDV与CSFV、PRV的三重混合感染的阳性检出率为17.10%，CSFV和PRV的混合感染阳性检出率为32.04%，从而说明在此次腹泻疫情中二者扮演着推波助澜的重要角色，同时也使部分猪场腹泻疫情反复发生的现象得以合理解释。究其原因是，两年来多数猪场在发生新生仔猪急性腹泻疫情时，均通过大面积使用发病仔猪的肠内容物和粪便来进行“强毒返饲”，使感染母猪产生高水平母源抗体以通过天然被动免疫的方式来保护初生仔猪，短期内取得了一定效果。但随之而来的问题是，若返饲病料中污染有CSFV和PRV强毒，必将造成母猪大面积感染，并垂直传播给胎儿，使其消化道和免疫器官功能不健全，当各类消化系统致病因子（尤其是PEDV）侵入消化道时，便会出现共同症状为腹泻，使疫情更为严重和复杂化，因此本研究结果提示猪场在进行返饲时应充分考虑病料中CSFV和PRV等强毒所带来的严重污染问题。

98个发病送检猪场中均检测出猪腹泻性疫病病原呈阳性，豫东、豫南和豫北地区等养猪较为密集地区的阳性场所占比例均匀，表明新生仔猪急性腹泻疫情在河南全省已广泛发生和流行，改变了“PED和TGE等腹泻性疫病多呈地方性流行”的传统认识。在季节分布上，以秋、冬季节阳性猪场占比例较多，但春、夏季节已呈逐步上升趋势，尤其是夏季也有15.31%的猪场发病，从而提示其季节性已不明显。管理水平较高、免疫和保健工作较为到位的规模化猪场的阳性场数远高于中小型猪场，其原因仍有待于进一步深入分析。本研究结果说明应把新生仔猪急性腹泻疫情纳入规模化猪场和中小型猪场全年高度警惕和重点防控的重大疫病。