亚麻酸对饲喂不同精粗比日粮的湖羊瘤胃细菌区系的影响

2013-02-20张春梅苑志朋易贤武刘建新

饲料工业 2013年11期

■ 张春梅苑志朋易贤武刘建新

(1.商丘师范学院生命科学学院，河南商丘 476000；2.浙江大学动物科学学院动物分子营养学教育部重点实验室，浙江杭州 310029）

亚麻酸是一种多不饱和脂肪酸，在植物油中含量丰富，以亚麻籽油和苏籽油中含量最高，可达50%以上。目前已有研究表明，反刍动物日粮中添加亚麻酸或富含亚麻酸的植物油可以显著降低温室气体甲烷的排放、改变瘤胃发酵模式[1-3]，且亚麻酸降低甲烷生成的效果与日粮类型有关[4]。然而亚麻酸调控甲烷排放的同时，对瘤胃微生物区系有何影响尚未可知。

近年来，随着分子生物技术的迅速发展，基于16S rDNA的分子生物学技术在胃肠道和环境微生态中被广泛应用，能对可培养和不可培养微生物群落进行多样性研究。基因指纹技术如变性梯度凝胶电泳（DGGE）能有效地分析瘤胃微生态系统的多样性、监测其种群的变化，可广泛应用于动物、日粮和环境因素等对瘤胃微生物生态的影响，是一种快速而有效的方法。茅慧玲等[5]利用该技术研究了日粮中添加茶皂素和豆油对羔羊瘤胃细菌区系的影响。淡瑞芳等[6]用该技术对藏系绵羊瘤胃细菌区系的季节变化进行了动态分析。成艳芬等[7]则用该技术研究了厌氧真菌分离培养过程中共存的甲烷菌种类及其多样性。本试验旨在通过PCR-DGGE技术，研究饲喂不同精粗比日粮条件下添加亚麻酸的湖羊瘤胃细菌的多样性及区系变化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用亚麻酸为乙酯型，购自河南利诺生化有限责任公司，具体成分为：酯化的α-亚麻酸71.21%；亚油酸13.67%；油酸11.40%；硬脂酸3.53%；酸价：2.25 mg KOH/g；过氧化物值0.044%。

1.2 试验动物及设计

8头平均体重为（35±3.3）kg的成年健康湖羊（瘘管羊和非瘘管羊各4只），随机分为4组，每组瘘管羊和非瘘管羊各一只，在整个试验期保持这种组合不变。4组湖羊按拉丁方设计分别饲喂4种日粮：高粗料日粮（F，精粗比为30∶70；不添加亚麻酸），高粗料添加亚麻酸日粮（FL，精粗比为25∶70；亚麻酸5%），高精料日粮（C，精粗比为70∶30；不添加亚麻酸）和高精料添加亚麻酸日粮（CL，精粗比为65∶30；亚麻酸5%），日粮的组成和营养成分见表1。每头羊每天分别饲喂1 kg基础日粮，包括600 g苜蓿干草和400 g精料。整个试验期分别于8:30和16:30准时喂料，自由饮水。

表1 日粮组成和营养水平

1.3 瘤胃液采集及总DNA的提取

试验期结束后，取瘘管羊瘤胃液并迅速放入冰盒终止发酵，瘤胃液用四层纱布过滤，分装后放入-80℃冰箱中保存。取解冻后混匀的瘤胃液样品1 ml，采用珠磨法提取总DNA[8]。

1.4 PCR扩增反应

利用一对细菌通用引物扩增细菌16S rDNA V3区[9]，上游引物为：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG，下游引物为：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG，由上海英骏公司代为合成。

PCR反应体系为50 μl，采用降落PCR，反应条件为：①94℃预变性 5 min；②94℃变性30 s，65℃退火1 min，72℃延伸 1 min，每两个循环退火温度降低1℃，共20个循环；③94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸 1 min，共10个循环；④72℃、10 min，最后4℃保温。PCR反应结束后取5 μl的PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.5 DGGE图谱及分析

参照茅慧玲等[5]的方法，对PCR产物进行DG⁃GE分析。采用8%的丙烯酰胺凝胶，变性梯度(甲酰胺和尿素)为38%～53%，电泳条件为：电泳温度为60℃，首先在200 V电压下电泳10 min，随后在100 V固定电压下电泳15 h。电泳结束后，进行硝酸银染色，参照Sanguinetti等[10]的方法进行。显色定影后的凝胶用GS-800灰度扫描仪(Bio-Rad，USA)进行扫描，Quantity One软件(Bio-Rad，USA)对DGGE图谱进行相似性和多样性分析。

2 结果与分析

2.1 瘤胃液细菌16S rDNA的PCR扩增

饲喂不同日粮湖羊瘤胃液总细菌16S rDNA的V3区PCR产物的电泳图谱见图1，片断大小在230 bp左右，与预期的大小一致。

图1 瘤胃液总细菌V3区PCR扩增产物电泳图谱

2.2 瘤胃液细菌区系DGGE图谱及多样性分析

图2显示的是不同处理组瘤胃液总细菌区系16S rDNA的V3区PCR扩增产物的DGGE谱带。图谱中有数十条谱带，反映了瘤胃内的优势细菌，泳带的数量和复杂性说明了瘤胃细菌的多样性。大多数条带在所有湖羊瘤胃液样品的DGGE图谱中存在，但高精料添加亚麻酸日粮明显多出了一些条带，见图2中标示。不同样品DGGE图谱的条带数存在一定变化，在26至49条之间（见图3）。统计分析显示，高精料日粮添加亚麻酸的条带数显著升高，其余处理组之间差异不显著。

2.3 瘤胃细菌区系的相似性分析

在不同日粮条件下饲喂亚麻酸湖羊的瘤胃液样品DGGE图谱的相似性见图4。各处理瘤胃液样品的微生物区系相似性指数处在43%～80%，个体差异比较大。总体上，16个处理的瘤胃液样品形成两个不同的簇，高精料日粮添加亚麻酸处理组单独形成了簇Ⅰ，其余的处理组形成了簇Ⅱ。

图2 亚麻酸在不同精粗比日粮下瘤胃液总细菌区系的DGGE图谱

图3 饲喂亚麻酸在不同精粗比日粮下湖羊瘤胃液的DGGE图谱中条带数

图4 饲喂亚麻酸在不同精粗比日粮下湖羊瘤胃液的微生物区系之间的相似性分析

3 讨论

瘤胃微生物非常复杂，且严格厌氧，由于缺乏独特的选择性培养基或用以判别细菌种类的特异代谢终产物，使对瘤胃生态系统的研究困难重重。近年来，基于16S rRNA基因的分子生物学技术促进了微生态研究的发展，特别是被称为DNA指纹技术的变性梯度凝胶电泳，能有效分析复杂微生物群落且无需培养，因而被广泛用于动物消化道菌群研究。茅慧玲等[5]利用PCR-DGGE技术研究日粮中添加茶皂素和豆油对羔羊瘤胃细菌区系的影响，DGGE图谱显示数十条清晰可辨的条带，且不同的日粮有差异条带存在，表明茶皂素和豆油的添加可选择性的促进或抑制一些菌的生长。本试验对饲喂不同日粮精粗比条件下添加亚麻酸的湖羊瘤胃液样品分析，检测微生物区系的变化。从DGGE相似性指数看出，各个处理组最相似的为80%，相似性最低的仅为43%，说明动物间的个体差异比较大，做瘤胃微生物方面的分析必须考虑这些因素。高精料日粮和高粗料日粮并未分成明显的两个簇，而是混杂在一起，说明改变日粮类型并未对瘤胃微生物区系产生大的影响。但高精料日粮添加亚麻酸显著增加了瘤胃液样品的DGGE条带数，也即显著增加了瘤胃微生物的多样性，且四个重复自成一簇，形成了典型的微生物区系结构，其原因和瘤胃微生物的具体种类尚有待于进一步研究。