瘤胃微生物体外降解稻秸和紫花苜蓿干草粉试验

■付钓钧 周清波 李佳琳 李春丰 王长平 赵瑞艳 戴志江

（1.佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154007；2.佳木斯市兽医卫生防疫站，黑龙江佳木斯 154007）

农作物秸秆具有多功能性，可用作燃料、肥料、饲料、工业原料、生物基料等，与广大农民的生活和生产息息相关。高效开发和集约利用农作物秸秆资源，有利于改善农村生产生活条件，促进农业增效和农民增收，对发展循环经济，构建资源节约型社会，推进社会主义新农村建设等具有重要意义[1]。本试验是通过用牛的瘤胃微生物体外降解不同比例稻秸粉与紫花苜蓿秸秆粉，探索底物有效比例，为人工瘤胃发酵生产生物蛋白质饲料提供科学数据。

1 材料和方法

1.1 试验仪器和试剂

1.1.1 试验仪器与设备

三角瓶、漏斗、玻璃棒、烧杯若干、容量瓶、量筒、注射器、镊子、胶头滴管、滤纸、纱布、温度计、分析天平（GH-120，日本AND）、GW-06A烘干箱（哈尔滨理化仪器制造厂）、pH酸度计（PT25型，德国塞多利斯公司）、粉碎机(ZN-02，北京兴时利和科技发展有限公司)、水浴锅（SC-15，上海比朗仪器有限公司）、恒温箱(DHG-9030，无锡三鑫精工试验设备有限公司)、双目显微镜（BM311110，北京视界通仪器有限公司）等。

1.1.2 试验试剂[2]

① 微量元素溶液（A夜）：称取CaCl2·2H2O 13.2 g，MnCl2·4H2O 10.0 g，CoCl2·6H2O 1.0 g，Fe-Cl3·6H2O 8.0 g，蒸馏水定容至100 ml。

② 缓冲溶液(B液)：称取NH4HCO34.0 g，NaHCO335.0 g，蒸馏水定容至1 000 ml。

③ 常量元素溶液(C液)：称取Na2HPO45.7 g,KH2PO46.2 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，蒸馏水定容至1 000 ml。

④ 还原剂溶液：称取NaOH 0.16 g，Na2S·9H2O 0.625 g，蒸馏水定容至95 ml。

⑤ 牛瘤胃液：取回瘤胃内容物后，经三层纱布过滤，获得牛瘤胃液并置于39℃恒温水浴条件下备用。

1.2 试验材料

1.2.1 紫花苜蓿干草与稻秸的处理

用40目粉碎机将新鲜晒干的紫花苜蓿干草和稻秸粉碎，备用。

1.2.2 动物的选择

牛是反刍动物，具有瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃四个胃室。在瘤胃中有大量的细菌、原生虫类和厌氧真菌类，代谢活跃，它们相互协调作用可以消化和分解饲料中的粗纤维，这是选择牛的主要原因。

1.3 试验方法

1.3.1 样品含水率测定

分别称取10 g稻秸粉和20 g紫花苜蓿干草置于培养皿中并放入烘干箱内在100℃烘干，烘干后称量，计算稻秸与紫花苜蓿干草的含水量(见表1)。

表1 烘干样品前后的重量（g）

1.3.2 样品分装（见表2）

表2 稻秸粉和紫花苜蓿干草粉按不同配比称量数值（g）

样品分装，按重量比例8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8称取已烘干的稻秸粉和紫花苜蓿干草粉，再用小药勺分装于60 ml三角瓶中，每个三角瓶中干物质总质量为1.4 g，2个空三角瓶备用。

1.3.3 人工瘤胃液的配制

①营养液的配制：蒸馏水400 ml+A液0.1 ml+B液200 ml+C液200 ml+还原剂溶液40 ml，用前新鲜配制，并预热至39℃。

②人工瘤胃培养液的配制：将牛瘤胃液与培养液按体积比1∶2配比，制成人工瘤胃培养液。

1.3.4 分装与培养

于佳木斯牛屠宰场取回瘤胃内容物后，经三层纱布过滤，获得牛瘤胃液并置于39℃恒温水浴条件下备用。取一滴混合均匀的瘤胃液置于载玻片上镜检。每个三角瓶中加入45 ml人工瘤胃培养液，成批转入恒温箱中培养，开始计时。每隔2 h观察一次试验结果，并记录其产气量，记录一次结果之后放空一次所产生的气体，记录结果后摇匀，连续培养36 h。连续培养36 h后停止试验记录，接下来9 h后将三角瓶内的底物取出进行过滤，过滤完毕后，把底物置于120℃下烘干箱内烘干。烘干后称量，计算干物质降解率[3]。

2 结果

2.1 各时间段的产气量(见表3)

表3 不同配比秸秆粉在不同时间的发酵产气量（ml）

某一时间段培养瓶净产气量计算公式：净产气量(ml)=某时间段重复试验组的2个培养瓶平均产气量(ml)。

2.2 干物质降解率（见表4）

表4 干物质降解率

图1 不同配比秸秆粉在不同时间的发酵产气量

图2 不同配比秸秆粉的发酵总产气量

3 讨论

从表3和图1中可以看出1～8 h产气速度都比较慢。前6 h产气量均为0 ml，6～8 h各配比中才陆续有产气，但产气量也不高。这是因为在发酵初级阶段微生物受到好氧杂菌的胁迫作用以至于不能很好的繁殖，随着发酵过程的进行，发酵罐内的氧气逐渐耗尽，瘤胃微生物开始繁殖，此时进入正常产气阶段，产气速度规律性变快，各组产气量增加，6～8 h稻秸粉与紫花苜蓿干草粉配比为3∶7和2∶8的产气量明显增加。10～12 h样本配比3∶7和4∶6组产气量最为明显，尤其是3∶7组产气量最多。而试验进行到14 h时，产气量普遍减少，而且有上下波动的现象，22 h后产气速度明显变慢，30 h后产气量呈直线下降，这是因为一方面在发酵过程中产生的代谢产物不能排出，随着代谢产物的累积，瘤胃微生物反馈受到抑制；一方面可能是发酵罐内的底物营养渐次消耗，繁殖受阻造成瘤胃厌氧微生物大量死亡，导致产气量减少。

图3 干物质降解率

从表4和图3中可以看出，样本配比3∶7组干物质降解率最高，发酵效果最好，4∶6组次之。这是因为紫花苜蓿干草中含有丰富的N元素，是很好的N源，可促进微生物生长，而且3∶7组C/N比最适合微生物生长。其他组由于N源不足，营养不平衡，搭配不合理，使瘤胃微生物不能很好的生长繁殖，干物质降解率降低[4-6]。

4 结论

通过产气体积和干物质降解率的计算比较，合理的稻秸粉和紫花苜蓿干草粉配比底物组成为3∶7较好，底物组成为4∶6的次之。因此，3∶7的稻秸粉和紫花苜蓿干草粉配比是本试验中最理想的瘤胃微生物体外发酵比例。试验也证实了瘤胃微生态很复杂，进行体外瘤胃微生物发酵时需要严格控制温度、厌氧、pH值、渗透压等环境，同时代谢产物若能够及时排出以消除反馈抑制，试验效果将会更明显。