胶体金免疫层析法快速定量检测饲料中呕吐毒素

■ 王 雄程宗佳王彦斐王 丽王 江

（1.北京中检维康技术有限公司，北京 100044；2.中粮营养健康研究院动物营养与饲料中心，北京 100020）

呕吐毒素又称为脱氧雪腐镰刀菌烯醇，属单端孢霉烯族化合物。1973年Yoshizawa首先分离得到了这种化合物，并命名为4-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，同年Vesonder等从污染镰刀菌并导致美国母猪拒食和呕吐的玉米中分离得到同样的化合物，将其命名为呕吐毒素。呕吐毒素主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生，容易对猪产生毒性，对人产生食物中毒性白细胞缺乏症。动物饲料中呕吐毒素的中毒症状表现为：厌食、呕吐、消化道发炎、白血球下降、白尿、运动失调、内脏出血、中枢神经系统细胞变质，具有较强的细胞毒性，对血液及皮肤组织具有损害作用，细胞生长上表现出抑制蛋白质合成和DNA合成的作用[1]。欧盟规定猪饲料中的呕吐毒素不得超过0.5 mg/kg,美国的规定是不得超过1 mg/kg，中国标准规定猪、犊牛和泌乳期动物配合饲料中呕吐毒素不得超过1 mg/kg[2]，中国农业部标准规定玉米干全酒糟（DDGS）中呕吐毒素也是不得超过1 mg/kg[3]。我国饲料及饲料原料中呕吐毒素污染非常严重[4-10]，最高值为32.9 mg/kg，为了保护动物健康和食品安全，需要加强对饲料产品中呕吐毒素的检测与控制。

目前测定呕吐毒素常用的检测方法有薄层色谱法[11]、酶联免疫法[12]和亲和柱净化-高效液相色谱法[13]。但这些分析方法需要大型的仪器设备、操作过程复杂、时间长，无法在现场和基础中小型实验室使用。近年来胶体金免疫层析技术在真菌毒素快速检测中得到应用[14-15]，但主要以定性检测为主[15-17]，存在显色模糊，人为判断有误差，假阳性假阴性比例高等问题。本文建立并验证了胶体金免疫层析法快速定量检测饲料中呕吐毒素的分析方法。

1 试验材料和方法

1.1 试剂和材料

除注明外,试剂均为分析纯,试验用水均为超纯水。

iCheck呕吐毒素定量快检卡（CS105，美国CLOVER）由包被有金标记呕吐毒素抗体的微孔、喷涂有呕吐毒素抗原检测线、鼠二抗控制线的测试卡和稀释缓冲液组成。稀释缓冲溶液：CSB-2，美国CLOVER。乙腈：色谱纯，美国JT BAKER公司。1.5 μm玻璃纤维滤纸：英国WHATMAN公司。呕吐毒素标准溶液：200 μg/ml，美国SUPLCO公司。呕吐毒素免疫亲和柱：IAC111，美国CLOVER公司。饲料样品：玉米、玉米酒糟、麦麸、猪饲料、鸡饲料。

1.2 仪器与设备

iCheck食品安全定量快检仪：Ⅱ型，美国CLOVER；通过对检测线和控制线的颜色分析而进行定量检测。高效液相色谱仪配紫外检测器：型号L-10A，为岛津公司产品。

液相色谱工作条件：①色谱分析柱：Cloversil ODS-C18柱,5 μm,4.6×250 mm；②流动相：乙腈+水(10+90，V/V)；③流速：0.8 ml/min；④进样量：20 μl；⑤柱温:25℃；⑥紫外检测波长：218 nm。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的提取

取50～250 g样品粉碎，过20目筛，称取5.0 g磨细样品加入到50 ml离心管中，再添加25 ml纯水，用多功能旋转混合器混合5 min(或者人工用手剧烈振荡3 min，或用高速均质器均质1～2 min)，用中速定性滤纸过滤，收集全部滤液。

1.3.2 免疫层析法快速定量检测

取滤液120 μl于抗体微孔中，加入30 μl稀释缓冲液，用移液器吸打8次混匀，取100 μl加入到快检卡样品孔中。37℃温育10 min后，将快检卡插入定量快检仪中读数，即为样品实际浓度。该方法的定量检测限为500 μg/kg，检测范围为0～5 000 μg/kg。读数值为500 μg/kg时，说明测定结果等于或大于500 μg/kg，如果需要进一步获得定量的检测结果，需要将样品提取滤液用纯水按一定比例稀释，然后进行检测，稀释倍数乘以仪器读数即为检测结果。

1.3.3 免疫亲和柱净化-HPLC法检测

粗过滤滤液用玻璃纤维滤纸再过滤，移取滤液2.0 ml过CLOVER呕吐毒素免疫亲和柱，调节流速约1～2滴/s，直至空气完全通过免疫亲和柱。分别用5 ml的纯水以约2～3滴/s清洗免疫亲和柱2次，直至空气完全通过免疫亲和柱。加入1.0 ml甲醇，调节流速约1～2滴/s的流速将免疫亲和柱中的呕吐毒素淋洗下来，用氮气将洗脱液吹干，加入0.3 ml流动相，混匀后20 μl注入液相色谱分析。

2 结果和讨论

2.1 免疫层析快速定量法准确性和重复性的试验结果

在空白样品中分别添加呕吐毒素为500、1 000、5 000 μg/kg浓度水平，然后按照免疫层析法快速定量检测（见1.3.2），其检测结果见表1。

表1 免疫层析快速定量法准确性和重复性的试验结果

从表1中回收率及精密度数据可以看出，本方法呕吐毒素回收率为75.7%～96.1%之间，室内3个水平添加5次重复的相对标准偏差在19.5%以内。

2.2 免疫层析快速定量法检出限和定量限的测定

取玉米、玉米酒糟、麦麸、猪饲料、鸡饲料5类样品用免疫亲和柱净化-HPLC法测定不含有呕吐毒素的空白样品各10份，用免疫层析法快速定量检测，结果见表2。我们定义空白样品测定平均值加3倍标准偏差SD为方法检出限(LOD)，测定平均值加10倍标准偏差SD为方法定量限(LOQ)。

通过对5类共50个空白样品中呕吐毒素的检测，可以确定免疫层析快速定量法测定呕吐毒素的检出限为200 μg/kg，定量限为500 μg/kg。

2.3 与免疫亲和柱净化-HPLC方法的对比试验结果

10个阳性样品，应用免疫亲和柱净化-HPLC法和免疫层析快速定量法分别进行检测（见1.3），其测定结果见表3。

表2 免疫层析快速定量法测定空白样品的试验结果(μg/kg)

表3 阳性样品的试验结果

表3中相对偏差的计算是以免疫亲和柱净化-HPLC法测定值为参考值，免疫层析法测定结果的最大相对偏差为17.3%，两组测定结果之间的相关系数为0.98，说明其相关性显著。

3 结论

胶体金免疫层析快速定量法测定饲料及饲料原料中的呕吐毒素，方法的检出限为200 μg/kg，定量限为500 μg/kg，相对标准偏差低于19.5%，回收率为75.7%～96.1%，其准确性和可靠性均可以满足欧盟[18]和中国[19]对呕吐毒素分析方法标准的技术要求：回收率70%～110%，CV小于20%。分析一个样品的时间为20 min内，与免疫亲和柱净化-HPLC法的相关性好。该方法简便快速、准确可靠、重复性好，可用于对饲料及饲料原料中呕吐毒素进行快速定量筛查检测。