微重力对细菌致病性的影响

王雅娟(综述)，刘长庭(审校)

随着人类对太空的涉足，有关空间生命科学的研究越来越深入。在人体表面、呼吸道和胃肠道均寄居着大量与人类健康息息相关的细菌。研究发现，在微重力条件下，一些条件致病菌的毒力和致病性增加[1]，可对宇航员的健康产生威胁。

目前，有关微重力环境下细菌致病性变化的研究越来越受到重视。由于受航天飞行时间、条件等因素所限，航天飞行器搭载实验实施较困难，为了在地面模拟微重力环境，美国国家航空航天局(National Aeronautics and Space Administration，NASA)发明了生物反应器(rotating wall vessel bioreactor，RWV)。RWV是一种垂直低速旋转(10～60r/min)、充满液体的圆柱形悬浮培养容器，在旋转过程中重力向量呈随机化分布，可模拟10－2g的微重力状态[2]，而其水平旋转时则是正常重力状态。基于这一原理，NASA又发明了高截面纵横比容器(high aspect ratio vessel，HARV)。目前二者均已广泛用于模拟微重力实验[3-4]。本文综合国内外文献阐述微重力环境下细菌致病性的变化及其可能机制，为解决未来太空飞行及空间站上航天员的健康维护及抗感染治疗提供新的思路和线索。

1 微重力对细菌毒力和致病性的影响

由于空间站上最大的微生物库是宇航员的肠内常驻菌群，有关微重力对细菌毒力和致病性影响的研究多集中在沙门菌和大肠埃希菌。在模拟微重力暴露下，沙门菌感染后第6天小鼠的生存率与对照组相比明显降低，感染后第10天其生存率仅20%，而对照组为60%[5]。另一项研究利用尾吊法使小鼠处于微重力状态，经口灌注浓度为1×107cfu/ml模拟微重力暴露后的鼠伤寒沙门菌，灌注后第3天的死亡率由原来的60%上升至100%。该研究还发现，在模拟微重力暴露后大肠埃希菌感染的小鼠巨噬细胞以及模拟微重力暴露后鼠伤寒沙门菌感染的小鼠上皮细胞中，肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌增加，ELISA法检测显示，大肠埃希菌感染巨噬细胞后感染4h，常重力对照组TNF-α浓度3.8ng/ml，而微重力实验组为9.5ng/ml。进一步将大肠埃希菌和巨噬细胞在模拟微重力条件下共培养4h，其上清液TNF-α的浓度高达35ng/ml。同样，鼠伤寒沙门菌感染小鼠上皮细胞实验中，模拟微重力组的TNF-α转录较正常对照组上升了12倍[6]。2006年，亚特兰蒂斯号航天飞机空间实验发现，与地面对照组比较，航天飞机搭载的沙门菌感染小鼠死亡时间提前，死亡率增高，半数致死剂量(LD50)降低，这一结论与既往地面模拟实验一致[7]。Orihuela等[8]研究发现，模拟微重力暴露后肺炎链球菌对细胞的黏附能力增加，同时一种黏附蛋白及其相关转移蛋白的表达量也有升高。Aviles等[9]使用大鼠尾吊模型进行模拟微重力研究，通过口腔灌注铜绿假单胞菌，发现微重力环境下大鼠对该致病菌的易感性增加，使用肺炎克雷白杆菌采用同样的模拟微重力方式也获得了相似结果。

为进一步探讨微重力致细菌毒力增强的机制，Chopra等[6]采用微阵列分析进行研究，结果发现经模拟微重力处理后鼠伤寒沙门菌的22个基因发生了变化，其中上调的基因有9个，主要是环境压力调节基因，而13个下调的基因包括多种转录调节和细菌毒力基因。他们利用双向凝胶电泳法发现产毒性大肠埃希菌和鼠伤寒沙门菌的蛋白表达谱均发生明显变化，并应用Northern blotting进一步证实产毒性大肠埃希菌编码毒力因子LT-1的基因发生了上调。Wilson等[10]在细菌mRNA水平的研究发现，与鼠伤寒沙门菌细菌毒力相关的基因(orgA、prgH、sipD、invI、invA、pigB、sseB、ssaL、ssaV、sseJ)在微重力环境干预后发生下调，上述基因编码沙门菌Ⅲ型分泌系统(type three secretion systems/injectisomes，TTSSs)，TTSSs与许多革兰阴性杆菌毒力因子的分泌有关，革兰阴性杆菌通过这些毒力因子感染人类、动物、昆虫和植物[11]。显然，这些基因的下调与前述微重力致细菌毒力增加的结论相矛盾，但其中机制尚有待探明。此外针对革兰阳性呼吸道细菌肺炎链球菌转录的研究发现，模拟微重力刺激相关的基因主要呈下调反应[12-13]，这与前述的革兰阴性肠道细菌研究结果并不一致。由上述研究可见，微重力对细菌来说是一个独立的刺激因子，可引起广泛的基因组、转录组以及蛋白组变化，但其机制尚不明确。幸运的是，在亚特兰蒂斯号航天飞机STS-115空间实验中，空间环境致沙门菌毒力增加的机制研究有所进展，Wilson等[14]发现与地面对照组比较，STS-115携带的沙门菌有167种基因表达发生变化，其中69种表达增加，98种表达下调，同时还发现，调控蛋白Hfq在微重力所致细菌侵袭性增加及巨噬细胞存活能力提高中起着重要作用。Hfq是一种RNA结合蛋白，通过与sRNA和mRNA结合发挥调节基因转录的作用[7]。此外，这项研究还发现培养基中的无机盐可抵抗微重力所致的鼠伤寒沙门菌毒力增加，在STS-115搭载过程中，鼠伤寒沙门菌分别在LB肉汤培养基和M9普通培养基(含有较高浓度的无机盐，其中无机磷酸盐比LB培养基高61倍)生长。结果显示，经航天搭载后，M9普通培养基中生长的沙门菌毒力并未增加，小鼠的LD50较地面对照组并未降低。地面模拟微重力实验提示，无机磷酸盐与产生这一现象的关系较大[14]。Hfq的作用在铜绿假单胞菌菌株PAO1的研究中也得到证实[15]。Crabbè等[16]的研究表明，PAO1经航天搭载后，167个mRNA基因和28种蛋白发生变化，Hfq即是主要转录调控因子之一。该研究还发现PAO1毒力相关基因——凝集素基因lecA、lecB以及鼠李糖基转移酶基因rhlA均发生明显上调，后者可促进鼠李糖脂的生成。

2 微重力对细菌生物被膜形成的影响

细菌生物被膜(或称细菌生物膜，bacterial biofilm，BF)是指细菌黏附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，这些物质将细菌包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物[15]。多糖基质除了多糖蛋白复合物，也包括周边沉淀的有机物和无机物等。生物被膜的形成受RpoS基因编码产物σS(RpoS蛋白)的调控[17-18]。σS是细菌RNA聚合酶的一个特别亚基，具有识别特定启动子的能力，RpoS基因的激活可启动一系列下游基因表达，使细菌适应恶劣的生长环境，从而稳定生长。生物被膜不仅可提高细菌对抗生素以及渗透压、酸碱性、过氧化等环境刺激的抵抗，而且在病变组织表面形成生物被膜可造成慢性持续性感染，因其可不断释放游离菌，同时生物被膜的主要成分藻酸盐可导致周围组织的变态反应，造成组织损伤[19]。

研究发现，在航天飞船上，细菌可生成更厚更稳定的生物被膜[20]。Lynch等[21]通过大肠埃希菌的模拟微重力实验证实了这一变化。为进一步研究其机制，研究人员敲除了大肠埃希菌的RpoS基因，发现该突变株在模拟微重力条件下生物被膜形成下降。因细菌生物被膜与细菌对环境的抵抗以及耐药性有关，该研究也发现模拟微重力暴露后的大肠埃希菌对氯霉素、青霉素、盐以及乙醇的抵抗力均有所增加。在模拟微重力条件下其RpoS缺失突变株对乙醇、盐的抵抗力也相应下降，但对抗生素的抵抗力却没有变化，这一结果提示模拟微重力对细菌生物被膜和耐药性的影响可能通过两种不同的途径发挥作用[21]。铜绿假单胞菌也同样被用来研究失重状态下生物被膜的形成，与大肠埃希菌相似，模拟失重暴露后的铜绿假单胞菌也形成更厚更稳定的生物被膜。模拟失重并不是直接通过诱导N-乙酰高丝氨酸内酯增加细菌毒力，而是通过启动信号级联反应产生超强毒性的铜绿假单胞菌[15]。

细菌生物被膜除了与人的感染性疾病有关，还能对金属材料产生腐蚀作用，在航天活动中可能腐蚀航天飞船或空间站的设备，因此研究空间环境对细菌生物被膜的影响至关重要。Mauclaire等[22]研究了两株从国际空间站上获得的藤黄微球菌菌株(LT100和LT110)，应用微量BCA蛋白试剂盒以及苯酚-硫酸比色法测定了其蛋白和多糖的变化，结果发现与地面菌株比较空间菌株LT110可产生更多的胶质碳水化合物，而LT100可产生更多的胶质蛋白，但同时还发现与在常重力条件下培养的菌株比较，在模拟微重力条件下培养的上述两株空间菌株以及地面对照株胞外多聚物质(EPS)生成均有所下降。因此，微重力对细菌生物被膜的影响并不单一，可能与细菌种类有关。虽然微重力是航天活动中空间环境的主要因素，但对细菌生物被膜的影响可能还是多种因素共同作用的结果。

3 微重力对细菌环境抵抗力及耐药性的影响

与地面常重力下生长的沙门菌相比，失重条件下生长的沙门菌表现出对环境刺激(如酸、热、渗透)更强的抵抗力。针对酸性环境的研究发现，失重条件下生长的沙门菌抵抗力增强的机制并不依赖于RpoS的调节，但编码铁摄取调节蛋白(ferric iron uptake regulator，Fur)的基因及其相关基因(fepD、sufC、sufS和feoB)却在模拟失重条件下发生变化，表明这些基因除了调控大肠埃希菌和沙门菌的铁代谢，也参与调控其他生理过程(如耐酸)。研究还发现微重力暴露后的Fur突变菌株对酸性刺激没有抵抗力。因此，Fur在模拟微重力暴露后沙门菌耐酸性增强机制中起着重要作用[23]。

早在1982年7月，Tixador等[24-25]从“礼炮7”空间站上法国航天员J. L. Chrien携带的共生菌丛中分离出金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，他们发现多黏菌素E和卡那霉素对大肠埃希菌的最低抑菌浓度与地面对照组相比从4mg/L增加到16mg/L，可见空间环境中大肠埃希菌产生了明显的耐药。而且红霉素、氯霉素和苯唑西林对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度也呈现少量增加。即使在没有抗生素存在的情况下，葡萄球菌在航天飞行中也出现了菌壁明显增厚的现象，这种细菌形态的变化与地面上在多酚中生长的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[24]和耐万古霉素金黄色葡萄球菌[26-28]非常相似。但细菌的这种耐药性变化并不稳定，在地面环境传代培养，其抗生素敏感性和细菌形态还可恢复到飞行前状态。1985年l1月在美国“挑战者”号和1992年1月在“发现”号航天飞机上的实验也进一步证实了上述现象[29-30]。然而，微重力条件下不同细菌对抗生素耐药性的变化并不一致。鲍曼不动杆菌在低剪切力模拟微重力的环境中对多种抗生素的最低抑菌浓度(MICS)并没有明显升高[31]。

4 前景展望

随着航天事业的发展，人类遨游太空、探索星球不再是梦想，但是太空环境复杂，如何保障航天员的健康至关重要。研究表明，太空飞行中航天员免疫功能下降[32-33]，细菌毒力增加，导致航天员发生感染的概率增加。

目前，多项研究表明微重力可增加多种细菌的毒力和致病性，且与相关的毒力基因、蛋白表达有关，但也发现了很多相互矛盾的现象[7,10]，例如模拟微重力暴露后沙门菌TTSSs系统下调，某些参与核糖核酸代谢的毒力基因(pnp和vacB，分别编码两种核糖核酸外切酶)的表达并没有变化。因此，关于微重力致细菌毒力增加的机制仍不明确。迄今为止，比较深入的发现是微重力所致细菌基因的变化主要受RNA结合蛋白Hfq的调控。

此外，微重力对细菌的影响并非完全一致，不同细菌在微重力条件下的毒性、基因水平改变及抗生素耐药性变化等都有所不同，例如Tucker等[34]发现大肠埃希菌MG1655经模拟微重力暴露后，并无特殊的微重力应答基因表达，发生变化的基因与细胞膜的结构有关，这一点不同于前述对沙门菌、致病性大肠埃希菌和产毒性大肠埃希菌的研究结果。目前对于致病菌的研究大多集中在肠道致病菌，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌也有少量的相关研究，但迄今为止，在“和平号”空间站(Mir)和国际空间站(International Space Station，ISS)上分离到的微生物远不止这些，除上述细菌外，还包括流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、阴沟肠杆菌、链球菌属等可致病的革兰阴性和阳性菌[35]。因此有关微重力对航天员细菌感染的影响仍有诸多问题亟待解决：微重力环境下多种可致呼吸道和消化道感染的细菌的致病性、耐药性等生理病理变化及其机制；微重力暴露后致病菌所致感染有何特点，宿主的反应与常重力对照组有何不同；经航天员或航天器携带返回地面的致病菌是否会对地面人群尤其是免疫力低下的人群产生严重危害等。此外，进行微重力对细菌生物效应影响的研究也有助于我们更好地理解重力对细菌的影响。

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