诱导性多潜能干细胞技术及应用研究进展

石 嵘，周珏宇，郑文岭，马文丽

(南方医科大学基因工程研究所，广东广州 510515)

诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)研究是近年来生命科学领域的重大突破。在传统的多潜能干细胞研究中，人们从哺乳动物的胚泡中直接获取胚胎干细胞，或利用体细胞核移植技术、成熟细胞与胚胎干细胞融合等方法获得成熟细胞的再编程，并利用其多能性的特点，将其定向诱导分化后用于帕金森病、神经损伤及糖尿病等疾病的治疗。然而，不论是胚泡的来源还是进一步的应用，都不可避免受到伦理学方面的问题及移植排斥反应等限制。而唯一的解决办法就是从患者体内获取细胞并将其直接诱导成多能干细胞，这种细胞就是现今所说的诱导多能干细胞(iPS细胞)。2006年8月日本京都大学Shinya Yamanaka课题组首先在《Cell》期刊上发表文章，证实了iPS细胞产生的可能性［1］。由于其具有非常诱人的应用前景，在最近几年中迅速成为生命科学领域研究的热点问题，并于2008年被《Science》评为年度十大科技进展最高奖，Yamanaka更因此获得了2012年诺贝尔生理学或医学奖。本文从iPS细胞的可行性研究、iPS细胞诱导技术优化研究、iPS细胞诱导机制研究、iPS细胞的临床应用、当前研究存在的问题这5个方面进行了概述。

1 iPS细胞的可行性研究

2006年，Shinya Yamanaka研究组首先通过对24个可能的候选基因筛选后发现，采用反转录病毒载体，仅需要向小鼠的胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cell，MEF cell)及成体成纤维细胞中导入 Oct3/4、Sox2、c-Myc和 Klf4这4个基因，就可以诱发细胞的再编程，从而产生形态学上类似于胚胎干细胞，即可以表达胚胎干细胞标记物的iPS细胞。这种iPS细胞植入裸鼠皮下，可以形成向3个胚层分化的畸胎瘤，而植入胚泡后则可形成小鼠胚胎，从而充分地证明了诱导产生的细胞具有多能性的特点，将其命名为iPS细胞［1－2］。然而，不同种属、不同组织来源、不同年龄、不同疾病患者的细胞能否诱导产生iPS细胞是决定iPS未来是否具有临床应用价值的重点。该实验迅速得到了其他实验室的重复证实［3－4］，并在人类胎儿、新生儿及成体来源的细胞中取得了成功［5－7］。与此同时，多个实验室分别证实成年小鼠皮肤细胞［8］、成熟 B淋巴细胞［9］、肝细胞、胃细胞［10］、神经干细胞［11－12］等多个不同组织来源、不同分化程度的细胞均可被诱导成为iPS细胞。哈佛医学院George Q．Daley实验室更是一次性地从人类腺苷酸脱氨酶相关重症联合免疫缺陷(ADA-SCID)、Shwachman-Bodian-Diamond综合征(SBDS)、III型高雪氏病 (GD)、杜氏(DMD)及贝克肌营养不良(BMD)、帕金森病(PD)、亨廷顿症(HD)、青少年 1型糖尿病(JDM)、唐氏综合征(DS)/21三体综合征、以及Lesch-Nyhan综合征携带者体细胞中成功诱导了iPS细胞［13］。此外，老年人体细胞也被证实可以被诱导成为iPS细胞。Dimos等［14］报道将一位患有肌萎缩侧索硬化的82岁老年女性的成纤维细胞成功诱导成为运动神经元。Stadtfeld 等［15］和 Daley 等［16］分别发表文章提出了iPS细胞诱导成功的分子标志物改变、功能性改变及其多潜能性的评价标准。

2 iPS细胞诱导技术优化研究

在证实iPS细胞可行性的同时，技术改进更是层出不穷。

首先是诱导因子的改进，在诱导iPS细胞的4个基因中，c-Myc是明确的癌基因，Klf4也被证实与肿瘤发生相关，Yamanaka课题组通过改变筛选方法获得了与 ES细胞更为接近的iPS细胞，并发现20%的c-Myc转染细胞后代出现肿瘤，以及用反转录病毒做载体并不安全［17］。同时 Meissner 等［4］采用了新的筛选方法，并认为通过形态学标准判断而不必用抗性筛选就可以直接从野生型细胞获得iPS细胞。因此，Yamanaka等［18］通过去除c-Myc转染及药物筛选，证实其他3个基因便可以使野生型小鼠及人细胞诱导成为iPS细胞，从而避开了c-Myc高表达导致肿瘤的可能。随后，Huangfu等［19］发现Oct4和Sox2两个基因就可以诱导人成纤维细胞产生iPS细胞，更进一步避开了Klf4导致肿瘤的可能性。Feng等［20］在小鼠体内通过孤独受体Esrrb与Oct4、Sox2基因配合，也可诱导产生iPS细胞。Kim等［11－12］证实，单一向成年小鼠神经干细胞中导入Oct4与Sox2两个基因，甚至Oct4一个基因即可将其转化成iPS细胞，并可在体外将其诱导分化成为神经干细胞、心肌细胞、生殖细胞。目前比较一致的观点就是c-Myc启动了再编程的过程，但在细胞向干细胞转变的过程中，则是Oct3/4、Sox2和Klf4这3个基因的作用，因此，c-Myc在iPS的过程中并非必需的因子。

除了导入基因进行细胞内表达外，研究者们也尝试了其他各种类型生物分子的诱导方法，Miyoshi等［21］和 Anokye-Danso 等［22］先后证实可以通过导入microRNA诱导形成 iPS细胞。Kim等［23］和 Zhou等［24］证实可以通过直接导入再编程蛋白诱导iPS细胞的生成。此外Warren等［25］通过体外人工合成并修饰的mRNA也高效诱导产生了iPS细胞，而Woltjen等［26］则通过转座重编程将成纤维细胞诱导成了iPS细胞。

其次是诱导方法的改进和安全性的提高。由于最初采用的反转录病毒有随机掺入宿主基因组的特点，因此从应用安全性角度考虑，研究者们改变了多种基因转染的方法，并分别取得了成功。Stadtfeld等［27］证实可以通过腺病毒载体转入基因，从而避免病毒基因掺入。Okita等［28］分别将c-Myc单独克隆在一个载体上，Oct3/4、Sox2和Klf4克隆在另一个载体上，这两个载体均为非病毒载体，并以此转染细胞，结果表明这些基因不整合入基因组，且成功诱导了iPS细胞。Jaenisch实验室则通过采用强力霉素(doxycycline)诱导表达载体前病毒，构建了转基因小鼠及细胞模型，使得iPS细胞的研究简化成通过单一药物诱导即可获得iPS细胞，从而使诱导过程实验背景大为简化，为机制研究以及诱导基因类似物的小分子化合物的筛选建立了模型［29－30］。

再次就是诱导效率的提高和速度的加快。通常iPS细胞的产生需要30 d左右，而其诱导效率较低。Huangfu等［31］通过导入小分子复合物DNA转甲基酶和组蛋白乙酰转移酶抑制剂，可以将iPS细胞诱导效率提高100倍。Aasen等［32］通过改进反转录病毒载体系统，诱导人包皮角质细胞，将诱导效率提高100倍以上，诱导速度增加1倍。

3 iPS细胞分子机制研究

在iPS细胞的产生机制方面，Yamanaka研究组通过基因芯片等大规模筛选方法找到了多个与iPS细胞产生相关的基因［1－2］，并发现其诱导过程伴随着ES细胞标记基因的激活与表达。Sridharan等［33］通过ChIP和基因芯片在全基因组水平上检测4个基因对于启动子的结合和基因表达的影响，发现iPS细胞与ES细胞中这4个基因的结合位点非常相似，而在部分再编程细胞(未完全多能化)c-Myc结合的基因被激活，但其他3个基因的下游基因没有被结合及激活。随后证明c-Myc在起始再编程的过程中发挥重要作用，而其他3个基因则有助于细胞多能性的恢复。

在iPS细胞产生过程中，尽管从一开始Yamanaka课题组便发现端粒、端粒酶及端粒相关蛋白也发挥了一定的作用，并影响其产生机制［1－2］，但研究迄今尚远不够全面。端粒研究领域著名的Maria课题组对iPS细胞形成过程中的端粒以及端粒酶变化做了较为深入的论述［34］。该文指出在将成熟细胞诱导成为iPS细胞的过程中，发现:1)细胞端粒依赖端粒酶变长;2)出现ES细胞特有的端粒染色质特征(如特定位点的甲基化);3)此端粒酶的激活不依赖c-Myc调控;4)在端粒非常短的 Terc－/－的小鼠中，iPS细胞的成率低，传代后很快失去多能性;5)端粒在iPS细胞中转录增加;6)老年捐献者细胞诱导成iPS细胞后端粒长度增加。但究竟端粒酶如何被激活，是否存在翻译后加工机制的作用，以及端粒结合蛋白shelterin在对端粒酶及端粒长度的调控中发挥何种作用，仍有待进一步深入研究阐明。

此外，有关iPS细胞与ES细胞的比较研究对于阐述iPS细胞的分子机制具有重要意义。多个研究组的研究结果表明，尽管两种细胞均具有多能性，但仍然存在本质的差别，一些鼠源性的iPS细胞畸胎瘤形成能力低于ES细胞，而人源性iPS细胞分化成为造血系统、神经上皮、神经元细胞系的能力弱于ES细胞［35－37］。对此学术界持有不同看法，有观点认为iPS细胞的分化能力本身就低于ES细胞，而更多的研究组则认为来源细胞(诱导前细胞)会在iPS细胞内留下表观遗传学的记忆，并对iPS的分化潜能产生特定的影响［38－39］。Bock 等［40］进一步在全基因水平构建了ES细胞和iPS细胞的甲基化谱及基因表达谱，在比较ES细胞和iPS细胞差异的同时，建立了一套评价多能干细胞特点及其分化潜能的评估体系，对于深入研究iPS细胞的分子机制提供了新的依据。

4 iPS细胞的临床应用研究

iPS细胞为研究临床疾病的发病机制、发现新药物和新治疗方法以及开展个性化治疗方面提供了重要的技术支撑。制备疾病特异性干细胞长期以来都是再生医学领域的目标，而iPS细胞的出现使得该目标变成了一项常规操作，当前有大量报道将各种患者来源的细胞诱导成iPS细胞，其中神经系统疾病包括帕金森病(PD)、亨廷顿症(HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩(SMA)、唐氏综合征、脆性X综合征等，血液系统疾病包括范可尼贫血、腺苷脱氨酶严重复合型免疫缺乏症(ADASCAD)、镰刀细胞型贫血、β-地中海贫血、原发性骨髓纤维化等，代谢系统疾病包括1型糖尿病、III型高雪氏病(GD)等。这些细胞模型为深入研究疾病的发病机制、体外药物筛选、治疗效果评价方面提供了一个非常有用的技术平台。

此外，在细胞替代治疗方面，iPS细胞由于不存在异体移植免疫排斥以及后续必须应用抗排斥反应药物的问题，具有广阔的临床应用前景。通过诱导iPS细胞定向分化，然后将细胞移植到特定部位发挥作用，用于治疗疾病，其中最具有代表性的一个例子就是Isacson等［41］通过将iPS细胞诱导成为多巴胺能神经元，然后移植到帕金森病模型大鼠的脑内，发现能够明显改善其症状，从而为iPS细胞在脑组织内的细胞替代治疗提供了重要的理论依据。此外，Hanna等［8］还将其应用于小鼠镰形细胞性贫血疾病模型的治疗，Xu等［42］将其应用于鼠血友病A模型的治疗，并取得了良好的疗效。而已建立的药物诱导iPS细胞的小鼠及细胞模型［29－30］，使得进一步的筛选研究及临床应用成为可能，这一切都使得iPS细胞的研究具有非常诱人的应用前景。

iPS细胞同时也为基因治疗提供了新的希望，在基因修复－细胞替代治疗方面，利用上述疾病来源的iPS细胞模型，可以完全不考虑免疫排斥因素，从而将重点全部放在基因修复的工作中。

《Science》近期还相继报道日本京都大学的Mitinori Saitou研究组将小鼠ES细胞和iPS细胞在体外诱导成为卵子和精子细胞［43－45］，这种体外将干细胞定向诱导成为单倍体生殖细胞的方法，为临床不孕症的解决提供了新的理论依据及新方案。

5 当前研究存在的问题

然而，要真正能够应用到临床，iPS细胞研究领域的3大问题仍急需进一步阐明和优化，即iPS细胞诱导效率问题、iPS细胞产生的机制问题、以及iPS细胞的安全性问题。其中更是以阐明iPS细胞产生的机制最为重要。

5.1 iPS细胞诱导效率问题

当前的iPS细胞研究尚属于实验性探索的阶段，根据绝大多数研究者的文献报道，从开始诱导到建立稳定的iPS细胞克隆所需要的时间至少在3个星期以上，而诱导效率则低于1/5 000 ～1/10 000［1-2，7］，也就是说1万个细胞中能被成功再编程并诱导成为干细胞的不超过1～2个。如果单纯从研究的角度来说，这种效率其实已经足够高了，因为单纯一次实验就可以获得数个iPS细胞克隆。然而，如果从临床应用的角度考虑，涉及到从患者体内分离并培养大量细胞以及临床治疗的时效性问题，则确实需要大大提高诱导效率，缩短诱导所需时间。目前主要通过选取更容易被诱导再编程的细胞来源、改进诱导方法等手段来提高诱导效率，而此方面的研究必将是今后iPS细胞走向临床应用领域的重点方向之一。

5.2 iPS细胞产生的机制问题

目前研究者们对iPS细胞的产生机制仍不明确，除了认为是由导入的4个基因激活了干细胞相关因子、诱导了细胞的再编程外，最初的研究也并不确定是否是因为反转录病毒掺入了细胞的基因组的特定位点导致再编程，或是在外周成纤维细胞培养中本身就存在具有未分化特性的祖细胞，还是细胞基因组已经发生了不能被染色体核型分析所检测到的微小改变，或者是外成性的改变导致了再编程的发生［2］。尽管随着目前研究的进展，一些诸如反转录病毒掺入等可能的因素已经被排除，但对其再编程发生机制全貌的了解，目前仍需大量的工作证明。而这一问题若无法解决，研究者们则无法对于每个iPS细胞均是否已彻底完成了再编程进行判断，也无法获得更为高效、安全的手段来诱导 iPS细胞［46－47］。因此，iPS细胞产生机制的研究已成为限制iPS细胞发展以及应用的最重要的瓶颈，也必将是未来iPS细胞研究领域重点突破的科学难题。

5.3 iPS细胞的安全性问题

安全性问题是iPS细胞走向应用领域的另一个重大问题，早期的iPS细胞诱导主要采用诸如反转录病毒(retroviruses)或慢病毒(lentiviruses)等病毒载体，但反转录病毒载体存在整合入宿主细胞基因组并导致肿瘤的问题，因此在应用的安全性上难以满足需要。目前技术上的很多改进包括采用非病毒载体，甚至采用药物直接诱导等方式，但即使不存在病毒基因的掺入，非病毒载体的质粒片段可能存在整合，药物也可能诱发基因的突变［46］。此外，导入的4个基因中c-Myc具有明确的致肿瘤作用，导入c-Myc的iPS细胞生成的嵌合体小鼠中50%都会发生肿瘤［17］，仅仅导入其他3个基因同样也存在一定肿瘤发生率。如何改进并研究出新的低致瘤性的诱导方法、提高iPS细胞的安全性是未来研究中的重点及难点之一。

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