黄曲霉菌感染花生的不同检测方法的应用

张慧丽 ， 杨 松 ， 苏君伟 ， 于洪波 ，徐文杰， 张丽男， 姜忠良， 孟宪军*

（1.沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳 110161；2.辽宁大学 轻型产业学院，辽宁 沈阳 110036；3.沈阳军区联勤部药品仪器检验所，辽宁 沈阳 110026；4.辽宁省风沙地改良利用研究所，辽宁 阜新 123000）

花生是我国重要的油脂和食品原料，是我国具有国际市场竞争力的出口创汇经济作物，产量居世界前三位。但是由于近年来黄曲霉菌在收获前期和保藏期的严重污染，合成的代谢产物黄曲霉毒素危害更是巨大，使我国的产量和交易优势已不再明显[1]。 寄生曲霉产四种主要黄曲霉毒素:B1，B2，G1，G2，而黄曲霉仅产B1和B2[2]。

黄曲霉毒素的污染分布于农作物生长、收获、储运及产品加工等各个阶段[3]，从农田到餐桌，从粮油、牛奶、调味品到饲料，覆盖广，严重危害人、畜、禽类的健康[4-8]，黄曲霉毒素是迄今已发现的各种真菌毒素中最稳定的一种，烹调加工温度100℃以上也不能将其破坏[9]，毒性是砒霜的68倍，敌敌畏的100倍，比剧毒的氰化钾毒性还大10倍之多[10-11]。对人及动物肝脏组织有破坏作用，低剂量长期摄入或一次大剂量摄入可引起肝脏的慢性或急性损害，严重时，可导致肝癌甚至死亡[12]，同时带来巨大的经济损失。据FAO报道，全球每年约有40%的食品原料受真菌毒素的感染，黄曲霉毒素就是其中之一，约有2%的农作物因污染严重而失去营养和经济价值[13]。

世界上针对花生抗黄曲霉菌污染展开了大量的研究，但是减少和消除黄曲霉毒素污染和危害的最有效的途径还是选育和推广抗黄曲霉花生品种[14]。自1967年Rao和Kulkarni发现不同品种花生对黄曲霉毒素污染具有不同程度的抗性以来，虽然迄今尚未发现高抗或免疫的抗性品种，但国内外已开展了大量对黄曲霉抗性筛选的研究[15-16]。筛选的重要方法之一是应用检测黄曲霉菌生长程度或黄曲霉毒素合成量的多少。目前，黄曲霉毒素的常规检测方法有薄层色谱法 （TLC）和高效液相色谱色谱法[17]，TLC一直是检测部门普遍使用的方法，由于HPLC测定法具有高效、快速、灵敏度高、重现性好、准确可靠等优点而得到越来越广泛的应用的，也是国际AOCO通用检测方法[18]。其他的联用技术也有研究报道，2010年郑荣等用免疫亲和柱净化，用高效液相色谱-柱后衍生-荧光检测器对黄曲霉毒素含量进行分析测定[19]。2012年栗建明等用快速液相色谱-串联质谱法测定食品中黄曲霉毒素含量[20]。为了能更好评估花生对黄曲霉菌的易感程度以及黄曲霉菌的生长率和毒素合成量的关系，作者联合黄曲霉毒素初定量的目测黄曲霉生长的表观评估法、半定量的TLC和精确定量的HPLC三种方法对花生进行综合评价，并筛选抗性品种[21-22]。不仅为黄曲霉毒素的污染检测方法提供理论依据，而且对该领域的分子生物学的进一步实验研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄曲霉A.flavus NRRL 3357:美国农业部南方研究中心；18份花生参试品:辽宁省风沙所提供16份品种，葫芦岛正业花生有限公司提供2份品种；甲醇和冰乙酸:色谱级，费舍尔公司；黄曲霉毒素标准品:西格玛公司；其他试剂:分析纯。

1.2 仪器与设备

PC-9301CS薄层扫描仪:日本岛津公司；硅胶G板:20 cm×20 cm，武汉药科新技术开发有限公司；高效液相色谱仪:紫外2487，泵1525，沃特斯公司；474荧光扫描检测器:沃特斯公司；HypersilODS反相色谱柱。

1.3 方法

1.3.1 黄曲霉侵染花生实验 接种A.flavus NRRL 3357到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，在28℃下倒置培养5 d，用0.05%曲拉通X-100水溶液制成浓度约为4×106个/mL孢子悬液后备用[23]。选取手工去壳、种皮饱满和大小均匀无损伤的花生品种15粒。用0.1%氯化汞水溶液消毒后接种4×106个/mL孢子悬液2 mL，置于28℃恒温生化培养箱内黑暗培养，7天后统计感染指数[14]。每个品种重复3次，平行实验3次。

1.3.2 采用传统分级标准评估黄曲霉感染实验黄曲霉菌侵染花生后，根据传统的分级标准，评估籽粒染菌程度，对黄曲霉毒素的含量进行初定量。分级标准如下[24]:

0级[0.0]:种仁正常；Ⅰ级[0.1]:种仁长出少数霉状物，占种衣面积1/10左右；Ⅱ级[0.2]:种仁长出霉状物，占种衣面积1/5左右；Ⅲ级[0.5]:种仁长出较多霉状物，占种衣面积1/2左右；Ⅳ级[0.8]:种仁多数长出霉状物，占种衣面积4/5左右；Ⅴ级[1.0]:种仁表面布满霉状物。

感染指数=（0.1n1+0.2n2+0.5n3+0.8n4+1.0n5）/N×100

式中，n为各级种仁染菌数值；N为供试总粒数。

根据黄曲霉对花生籽粒的感染指数划分，R（抗）: 感染指数＜5.0；MR （中抗）: 感染指数5.1～10.0；MS（中感）:感染指数 10.1～30.0；S（感）:感染指数 30.1～50.0；HS（高感）:感染指数＞50.1。

1.3.3 黄曲霉毒素的提取 根据由AOAC标准测定方法[18]。花生样品50 g与200 mL的甲醇-水（85∶15）混合，摇匀。将混合物过滤，收集滤液并用25 mL的正己烷进行脱脂肪，再将其放入25 mL的氯仿中。将氯仿蒸干，然后将残渣转移到带有氯仿的玻璃瓶中。然后在40℃温和的氮中将氯仿蒸发掉。残渣在250 mL的氯仿中再溶解并且存在-20℃条件下，直到被分析。

1.3.4 薄层层析法（TLC）检测黄曲霉毒 分别吸取18种参试样品毒素提取液和20 ng/mL的黄曲霉毒素标准品，在硅胶板上距底端2 cm处按标记点样10 μL，放入加盖平衡半小时后的丙酮-三氯甲烷展开剂中。将薄层板点样一端浸入展开剂中密闭展开。当展开层剂前沿达到薄层板的2/3高度时，取出层板。放入通风橱中晾干。在365 nm紫外灯下观察照相荧光斑点。将展开后的层析板放到薄层扫描仪中370 nm处扫描，根据扫描得出的峰面积对样品感染的黄曲霉毒素含量进行半定量测定。

1.3.5 高效液相法测定黄曲霉质量浓度 根据前期的结果，将毒素质量浓度最多的和最少的样品进行HPLC，测定黄曲霉质量浓度。标准品黄曲霉B1质量浓度为50 ng/mL，色谱条件:色谱柱Hypersil ODS，3 mm×100 mm×4.6 mm；流动相:甲醇-水-冰乙酸（45∶55∶2）；流速 1.5 mL/min；进样量:10 μL；荧光检测器激发波长360 nm，发射波长440 nm；运行时间22 min。

2 结果与分析

2.1 花生感染黄曲霉的表观特征

花生籽仁接种黄曲霉菌1 d后，可见籽仁饱满，有发芽的迹象，2 d后可见籽仁表面有少量的灰白菌丝体，5～7 d 后可见绿色孢子簇产生，7～10 d，孢子堆满种仁表面的某一部位，菌丝逐渐蔓延甚至包裹整个花生，孢子簇向整粒种子扩散。花生仁失水，略有干瘪。

2.2 采用传统分级标准评估黄曲霉毒素实验

通过接种黄曲霉菌来感染花生，未发现对黄曲霉菌感染有免疫能力的种质。黄曲霉菌能侵染所有被鉴定的18份花生并生长，但生长势和感染指数在不同品种之间差异很大。18份花生品种平均结果见图1。高抗品种2份，分别是:白沙1016和阜花11号，感染指数＜5，明显高于其他花生品种的抗性。中抗品种2份，分别是远杂9102和304，感染指数在5.1～10.0。中感品种12份，分别为螺4087、2009-6、阜花 1.2、花育 20、鲁花 12 号、徐 9703、莱农 26、阜花 14、R-08-3、阜花 12、珍珠红、9820-1，感染指数在10.1～30.0。高感品种2份，分别为红崖子小白沙和红崖子四粒红，感染指数＞30.1。

图1 不同品种感染黄曲霉差异比较Fig.1 Difference peanut lines infected by Aspergillus flavus

2.3 薄层层析法（TLC）检测黄曲霉毒素

花生感染黄曲霉菌后在适宜的条件下产生毒素，对感染后的花生进行黄曲霉毒素提取，经过点样、层析、扫描后，通过对比各品种的峰面积，得出18种花生的黄曲霉毒素质量浓度，见表1、图2和图3。

图2 黄曲霉毒素荧光薄层色谱（FLU-TLC）Fig.2 FLU-TLC of Aflatoxin

图3 荧光薄层的峰面积Fig.3 Peak area of FLU-TLC

由扫描结果可知，红崖子小白沙的峰面积最大，黄曲霉侵染后的产生的毒素最多，质量浓度为30.92 ng/mL，红崖子四粒红的峰面积与红崖子小白沙相近，而阜花11的最小质量浓度为2.72 ng/mL，产生的黄曲霉毒素最少。

综合感染实验和黄曲霉毒素含量检测的实验结果，可知花生品种分为抗黄曲霉菌感染和抗产毒素两个方面，本实验选用的品种侵染率和合成毒素质量浓度基本一致。通过对18份花生的筛选鉴定发现，感染率高的品种，产毒量一般都较高，例如红崖子小白沙、红崖子四粒红、螺4087等，而感染率低的品种，产毒量可能较高或较低，例如远杂9102的感染率低于R-08-3、阜花12、珍珠红等，但其产毒量却明显比它们高；而白沙1016和阜花11的感染率是最低的，它们的产毒量也最低。

2.4 高效液相色谱法（HPLC）检测黄曲霉毒素

对感染后的花生进行黄曲霉毒素提取，并用高效液相色谱法测定红崖子四粒红和阜花11黄曲霉毒素提取样品，将峰面积与标准品进行比较，得出红崖子四粒红中黄曲霉毒素质量浓度为30.21 ng/mL，阜花11中黄曲霉毒素质量浓度为2.55 ng/mL，见图4。

表1 花生品种感染指数和FLU-TLC结果Tab.1 Infection Index and FLU-TLC valueof Aflatoxinon peanut lines

图4 高效液相色谱测定黄曲霉质量浓度结果Fig.4 HPLC Value of Aflatoxin on peanut lines

3 结语

花生黄曲霉感染是一种普遍但危害巨大的病害，虽然其发病程度受环境和实验条件的影响很大，目前还难以制定统一的抗性分级标准，但本方法是在基于表观评估、TLC半定量法和HPLC准确定量的方法的基础上建立起来的。通过实验表明，选取的花生品种这三种方法基本一致，特别是易感和抗性品种中具有高度的一致性。抗产毒的能力鉴定，主要依赖于对感染了黄曲霉菌的花生进行黄曲霉毒素检测，测得的质量浓度越低，表明该品种抑制黄曲霉菌产毒的能力越强；反之，则表明该品种的抗产毒性越弱[25]。

作者采用黄曲霉NRRL3357菌株是具有代表性的黄曲霉测序的菌株，鉴定出的高抗品种，对黄曲霉具有普遍抗性，可以作为花生品种抗黄曲霉的初筛依据[26]。经接种后的花生仁上霉菌孢子较多，故未对样品进行磨碎处理，只直接提取了整粒样品的部分毒素，花生内部的毒素没有计算在内。

本研究鉴定筛选出2个高抗黄曲霉毒素的花生品种，分别是白沙1016和阜花11。实验结果表明，这两种花生既是抗感染又是抗产毒的品种，可作为在种植和保藏期期间抵抗黄曲霉菌的优良品种来源，具有一定意义上的推广价值，这不仅有利于提高花生的质量，减少黄曲霉毒素的产生和沿食品饲料链传递，还真正保障了食品安全和人民健康。

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