黑加仑花色苷抗禽白血病A亚群病毒作用

雷用东， 王 丹， 童军茂， 张 莉， 马 越， 张 超， 赵晓燕*

（1.北京市农林科学院 蔬菜研究中心，北京 100097；2.石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832003）

黑加仑（Blackcurrant），拉丁名 Ribes nigrum L.，学名黑穗醋栗，在我国东部地区广泛种植[1]。研究发现，黑加仑花色苷提取物 （Anthocyanins from Blackcurrant，ACB）具有抑制肝细胞癌[2]，清除自由基和抑制胃癌细胞增殖[3]，减少动脉粥样硬化血栓的形成，抗炎症[4]和抗疲劳作用[5]等功能。禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的以造血细胞恶性增生为主的一类传染病。目前ALV 分为A～J 10个亚群，A、B、C、D为外源性病毒，E为内源性病毒[6]。近年来，在我国不同规模的养鸡场中，由鸡群中经典外源性ALV-A感染而引起的恶性肿瘤的病例显著上升，已给养殖业造成了很大经济损失[7]。因此，作者在结合国内外对ACB的抗癌功能研究的基础上，采用细胞模型，通过ACB对ALV-A诱导的DF1细胞形态学变化及细胞存活情况的影响，在体外开展其抗病毒活性的研究。本研究结果为ACB预防ALV-A病毒药物的开发提供理论依据，并为人类预防白血病病毒提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

黑加仑花色苷粉:购自北京绿色金可生物技术股份有限公司；DF1细胞、ALV-A病毒:由北京市农林科学院畜牧所提供；高糖DMEM培养基:购自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）:购自澳大利亚Gibco公司；胰蛋白酶:购自美国 BD 公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐 （MTT）、二甲基亚砜（DMSO）:购自 Sigma 公司；盐酸阿霉素（DOX）:上海生工；其余试剂均为国产分析纯。

液质联用仪（HPLC 1200系列，MS 6310系列）:Agilent公司；超净工作台YT-CJ-2NB:北京亚泰克隆实验科技开发中心；倒置生物显微镜BDS200:OPTEC奥特光学；CO2水套式培养箱:Thermo公司；细胞自动计数分析仪CYT-100:CYTORECON公司；酶标仪550:Bio Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑加仑花色苷的主要成分分析

1）样品制备:ACB粉首先用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液稀释成质量浓度为1 mg/mL母液，0.22 μm针式过滤器过滤，-20℃保存备用。

2）HPLC分析条件:紫外检测器，波长:520 nm；流动相:A 5%甲酸水溶液，B 100%乙腈；分离柱:C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）。进样量 5 μL，流速 1 mL/min，柱温25℃，梯度洗脱程序为:0～8 min，13%～22%B；8 ～15 min，22% ～23%B；15 ～20 min，23% ～100%B；20～25 min，100%B；25～26 min，100%～13%B；26～33 min，13%B。

3）MS分析条件:采用正离子模式，扫描范围为100～1 500（m/z）；N2流速为 12 L/min；喷雾器压力为310 kPa；干燥气温度为350℃。

1.2.2 细胞培养 参照文献[8]所描述的细胞培养方法，按体积比10∶1的胎牛血清与高糖DMEM培养基混合，在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中对DF1细胞常规培养，隔天传代，调整细胞生长状态，一般以传代数为3～6生长良好的细胞，进行实验。

1.2.3 黑加仑花色苷对DF1的毒性试验 为了解ACB对DF1的细胞毒性，采用常规MTT实验方法[9]，取生长良好的DF1细胞（细胞悬浮浓度为2～3×105 cells/mL），每孔 200 μL，接种于 96 孔细胞培养板内，置于5%CO237℃培养24 h后，对照组不加ACB，样品组每孔内分别加入ACB使其终质量浓度分别为 2、4、6、8、10、12、14 μg/mL，每个浓度设 6 个平行孔，然后置于培养箱内，分别在 24、48、72、96 h后，弃除培养液，每孔内分别入MTT溶液10 μL，37℃继续孵育4 h后，终止培养，弃除上清液后，每孔加入170 μL二甲基亚砜，微量振荡10 min，使MTT还原产物完全溶解，用酶标仪在490 nm处测定对照组和样品组各孔吸光度（OD）值，通过OD值的大小间接反应ACB的细胞毒性。

1.2.4 黑加仑花色苷体外抗ALV-A活性试验

1）黑加仑花色苷体外的预防病毒试验:按照1.2.3 ACB对DF1的毒性试验方法，取生长良好的200 μL细胞悬液，置于96孔细胞培养板内，约80%形成单层细胞，弃生长液，向孔中加入样品稀释后的样品母液，使其终质量浓度为 2、4、6、8、10 μg/mL，37℃孵育1 h后，加入20 μL ALV-A病毒液再孵育1 h，2%FBS的细胞维持液每孔补至200 μL。分别在24、48、72、96 h后， 采用 MTT法在 490 nm 测定OD值。试验设细胞对照、病毒对照和阿霉素对照，6个平行孔，3次重复实验。

2）黑加仑花色苷体外的治疗病毒试验:同1.2.3方法，准备4个DF1长成约80%单层细胞的96孔板，弃生长液，每孔加20 μL ALV-A病毒液，37℃孵育1 h后，向孔中加入样品母液，使其终质量浓度分别为 2、4、6、8、10 μg/mL， 细胞维持液补液体至200 μL。 分别培养至 24、48、72、96 h 后，采用 MTT法在490 nm测定OD值。

1.2.5 黑加仑花色苷与ALV-A对DF1细胞形态学试验 按照1.2.4实验方法，取生长良好的DF1细胞（细胞悬浮浓度为 5～7×105cells/mL），接种于 25 cm2细胞培养瓶中，置于5%CO2、37℃培养箱培养成单层，弃生长液，加入500 μL ALV-A病毒液，37℃孵育1 h后，向孔中加入ACB母液，使其终质量浓度分别为2 μg/mL和8 μg/mL，细胞维持液补液体至5 mL。试验设细胞对照、病毒对照和治疗对照。

1.2.6 数据统计分析 本实验结果数据采用Origin8软件作图、Agilent ChemDF1ation Rev.A.09.01 software和DPS统计软件分析，数据均以平均数和标准偏差（±SD）表示，采用 Duncan 新复极差多重比较。

2 结果与分析

2.1 黑加仑花色苷的HPLC-MS成分分析

黑加仑花色苷的HPLC色谱图见图1。

图1 黑加仑主要花色苷的HPLC色谱图（520 nm）Fig.1 HPLC profiles（520 nm） of the major anthocyanins from Blackcurrant

由图1可知，黑加仑主要含两种成分。作者鉴定出两种花色苷，见表1，与文献[10]鉴定花色苷组分相似，飞燕草及矢车菊素类花色苷为其主要成分。然而与前人研究结果不同的是，作者未检测出天竺葵色素类花色苷，可能是黑加仑的品种、采收时间及其种植地域等因素导致。

表1 黑加仑中主要的花色苷成分Table 1 Major anthocyanin components of Blackcurrant

2.2 黑加仑花色苷对DF1细胞毒性的研究

研究不同质量浓度的ACB对DF1单层细胞的毒性作用。从表2可以看出:细胞对照组在72 h与96 h的OD值大小一致，无显著水平差异，说明96 h时为细胞生长达到最大程度的时间值。同一时间段下，当在质量浓度小于10 μg/mL各处理组，随着ACB质量浓度的增加，OD值均比对照组高或者无水平差异，具有量效依赖性，说明ACB对 DF1细胞的生长有促进作用或者无毒性作用；当ACB质量浓度高于10 μg/mL，各处理组OD值与细胞对照相比，OD值呈下降趋势，DF1生长受到不同程度抑制，有显著性差异，差异具有统计学意义。在24、48、72、96 h四个时间段中，质量浓度小于10 μg/mL各处理组均显著高于对照组，但是在时间上的水平差异并不显著。本研究体外试验时加入ACB，对正常DF1细胞的有无细胞毒性作用，当ACB质量浓度大于10 μg/mL时，各细胞组存活情况显著下降，说明10 μg/mL是ACB对DF1细胞无细胞毒性的最大安全质量浓度。贾娜等[11]研究证实黑加仑花色苷具有清除自由基能力，推测ACB能清除细胞产生有害物质，因此一定质量浓度范围内ACB可能提高了DF1细胞机能，从而促进其生长。

2.3 黑加仑花色苷体外抑制ALV-A活性的研究

阿霉素（DOX）为常见的抗肿瘤药细胞毒类药物，对白血病有明显的治疗效果[12]。本试验前期已探讨出DOX质量浓度为200 ng/mL对禽白血病A亚群有良好的治疗效果，为本研究作为很好的药物对照样品。本实验在ACB对DF1生长影响的最大质量浓度在10 μg/mL范围内，展开对ACB抗ALV-A活性的研究。

表 2 ACB 对 DF1 细胞毒性（±s，n=6）Table 2 Cytotoxicity of ACB on DF1 cell（±s，n=6）

表 2 ACB 对 DF1 细胞毒性（±s，n=6）Table 2 Cytotoxicity of ACB on DF1 cell（±s，n=6）

注：采用Duncan新复极差多重比较法分析，不同字母表示每行时间之间的5%显著水平差异，斜体字母表示每列质量浓度之间的5%显著水平差异。

质量浓度/（μg/mL）2448时间/h 7296 0 2 4 6 8 1 0 12 14 0.591±0.026bbc 0.681±0.036ca 0.664±0.006aab 0.648±0.056cab 0.689±0.076ba 0.596±0.022bbc 0.523±0.013cc 0.433±0.063bd 0.860±0.049aa 0.868±0.031ba 0.861±0.046ba 0.840±0.040ba 0.867±0.052aa 0.845±0.022aa 0.728±0.028ab 0.667±0.021ab 0.902±0.059aa 0.893±0.025aba 0.880±0.044aba 0.928±0.029aa 0.931±0.040aa 0.872±0.042aa 0.680±0.038ab 0.512±0.062cc 0.914±0.043aa 0.952±0.074aa 0.964±0.051aa 0.952±0.024aa 0.959±0.026aa 0.905±0.029aa 0.629±0.064bb 0.420±0.013bc

2.3.1 黑加仑花色苷对ALV-A的预防试验结果研究ACB对ALV-A的预防作用，即向DF1单层细胞预先加入ACB，再加入ALV-A感染细胞，起到预先防治作用。从表3可以看出，在各时间段下，药物阿霉素对照的OD值均高于病毒组，有显著性差异，说明阿霉素对ALV-A起到了治疗作用。同一时间下，ACB各质量浓度处理组的DF1细胞OD值均显著高于病毒对照组，具有量效依赖关系。其中72 h时，添加ACB质量浓度8 μg/mL的OD值为0.874，明显高于病毒对照OD值0.789，有显著性差异，说明在体外ACB质量浓度8 μg/mL对ALV-A病毒有一定的预防作用。在作用时间效应上，ACB对ALV-A抑制作用也比较明显，但是在同质量浓度间差异性比较小。本实验结果表明:ACB各质量浓度处理对ALV-A的具有预防作用，可明显抑制ALVA在DF1细胞上的增殖。陶欣艺等[13]研究表明，花色苷能抑制氧化应激诱导的神经细胞凋亡，ACB可能通过提高细胞机体内的抗氧化酶类活性，减少由有害因素引起自由基的增加，从而减慢ALV-A在宿主细胞上的增殖。

表3 不同质量浓度ACB体外对ALV-A的预防效果Table 3 Influence of prevention on ALV-A under different concentration of ACB in vitro

2.3.2 黑加仑花色苷对ALV-A的治疗试验结果研究ACB对ALV-A的治疗作用，即加入ALV-A预先感染DF1单层细胞后，再用ACB处理，起到治疗作用。从表4可以看出，阿霉素药物治疗对照组的各OD值均高于病毒组，治疗效果明显；同一时间下，ACB各质量浓度处理组的OD值均显著高于ALV-A病毒对照组，随着ACB质量浓度增加，其OD值逐渐上升，差异显著，呈量效依赖关系。其中在72 h时，ACB质量浓度8 μg/mL时的OD值为0.843，与ALV-A病毒对照的OD值为0.753，呈显著性差异。因此，在体外ACB对ALV-A病毒具有一定的治疗作用。

表4 不同质量浓度ACB体外对ALV-A的治疗效果Table 4 Influence of treatment on ALV-A under different concentration of ACB in vitro

作者研究发现，ACB对ALV-A的预防作用比治疗作用明显。在相同质量浓度下，预防试验的OD值比治疗试验的高，结果见表3，4。提示ACB对ALV-A的预防作用比治疗作用显著，推测这可能与细胞性继发作用有关[14]。运用ACB进行干扰溶酶体膜通透性，减缓细胞自溶速度，从而保护正常细胞。因此，给家禽添加适量ACB的饲养，能增强机体的抗病毒能力，对ALV-A起到早期预防作用。

2.4 黑加仑花色苷与ALV-A对DF1细胞形态学的影响

观察发现，DF1单层细胞感染ALV-A病毒后，一般在5 d左右出现比较明显的病变，表现为细胞脱落、形态改变，或形成病斑。正常DF1形成单层细胞后，细胞呈长梭形或扁平星形，大小均匀[15]。生长至5 d，采用倒置显微镜图显示:图2a为正常DF1细胞对照，细胞形态较为完整，有部分细胞脱离单层，是由于培养5 d后其营养物质的消耗和有害代谢产物积累而导致；图2b显示ACB质量浓度为8 μg/mL处理正常细胞，单层细胞表面完整，折光性好，无空隙，很少破碎死亡，细胞生长状态良好；图2C为DF1细胞受ALV-A病毒感染，出现明显细胞形态完全改变，空泡化，大部分细胞已经脱离单层，发生严重的病变；图2d为阿霉素药物对照，只有少量细胞脱离单层，细胞形态较为完整；图2e为ACB质量浓度2 μg/mL作用于ALV-A诱导的DF1形态，结果显示有细胞脱离单层，细胞间隙增加，占70%的细胞保持单层状态；图2f显示ACB质量浓度8 μg/mL作用于ALV-A诱导的DF1形态，细胞有部分脱落，约80%的细胞保持单层状态，与图2E比较，其细胞形态较好。因此，ACB能保护DF1的细胞形态，对ALV-A病毒繁殖有一定的抑制作用。

图2 ACB对DF1细胞形态的影响（×250）Fig.2 Effect of ACB on DF1 cell morphology under microscope （× 250）

3 结语

目前我国对花色苷类作为抗病毒药物的研究相对比较薄弱，主要集中在花色苷抗肿瘤的研究上，对禽白血病病毒的系统研究还不够深入，对花色苷抗病毒的药理作用研究才处于起步阶段。作者通过研究表明，黑加仑含有飞燕草色素-3-鼠李糖苷-5-葡萄糖苷和矢车菊色素-3-鼠李糖苷-5-葡萄糖苷两种主要花色苷成分；黑加仑花色苷在体外具有一定的抑制禽白血病A亚群病毒增殖作用，并随剂量的增大呈量效依赖关系，同时对DF1细胞抵抗力有明显的增强作用。作者用黑加仑花色苷混合物进行抗病毒研究，其抗病毒效果其含有的花色苷种类有关，具体哪种花色苷单体或者花色苷复合物起作用更佳，其确切机制还有待于深入研究。

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