一株好氧除磷菌P10的筛选及除磷条件的优化研究

仲小敏， 堵国成， 陈 坚

（1.江南大学 环境与土木工程学院，江苏无锡 214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

随着人口增长，城市化高速发展，人类活动产生的生活废水、工业废水及农业废水等加快了水体中碳氮磷含量的增加[1-2]，氮磷作为水体富营养化的重要因素之一[3-4]，其控制及减排成为水污染防治工作的重点。近年来污水生物除磷技术一直在不断研究更新[5-7]，国内外对除磷菌的筛选及性能研究也在不断取得进展。有部分研究者对假单胞菌和恶臭假单胞菌在好氧条件下吸磷和厌氧条件下释磷的除磷特性进行了初步研究[8-11]。作者对筛选的好氧除磷菌P10进行研究，优化其生长及除磷条件，为除磷微生物制剂化的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种来源 从江南大学环境工程实验室性能稳定的实验室规模A/O反应器沉淀池中的剩余污泥在牛肉膏蛋白胨培养基上划线分离出的，经蓝白斑筛选法初筛并在好氧除磷能力检测实验中具有良好除磷能力的菌株P10。

1.1.2 培养基

1）牛肉膏蛋白胨（每升）[10]:牛肉膏3 g，蛋白陈10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.02 g，水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。

2） 葡萄糖-MOPS[7]。

3） 扩培培养基（每升）[9]乙酸钠 5 g，NH4Cl 2 g，KH2PO40.25 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.2 g，pH 7.0～7.2。

4）模拟污水（每升）[9]:乙酸钠 925 mg，蛋白胨0.1 g， 酵母膏 0.01 g，NaCl 0.05 g，KH2PO465.5 mg，MgCl2·7H2O 153.7 mg，CaCl225 mg，pH 7.0～7.2。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株鉴定 菌株的16S rRNA部分列克隆及测序 将克隆序列送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将16S rRNA的测序结果进行比对和同源性分析。

1.2.2 磷的测定 钼锑抗分光光度法 （GB 11893-1989）。

1.2.3 扩大培养 200 μL菌体接种于50 mL扩培培养基，在30℃，200 r/min条件下摇床培养20 h后接种于合成废水测定合成废水中培养前后磷含量。

1.2.4 除磷能力检测 将6 mg菌体接种于100 mL合成废水（接种量5%），在30℃，200 r/min条件下摇床培养8 h后测定合成废水中培养前后磷含量。

2 结果与讨论

2.1 除磷菌的筛选与鉴定

经过10次富集、8次分离纯化，蓝白斑固体培养基初筛好氧除磷能力检测后，从污泥中筛选到一株除磷能力强的细菌，编号P10。在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上培养48 h，菌落为米白色、圆形、不透明、表面光滑，凸出。其电镜照片（扫描照片，放大24 000倍）见图1。提取基因组序列因经PCR扩增后克隆测序，将得到的16S rRNA进行比对及同源性分析，经鉴定，为 Pseudomonas putida。

图1 Pseudomonas putida P10的电镜形态特征Fig.1 Transmission electronic micrograph ofstrain Pseudomonas putida P10

2.2 Pseudomonas putida P10生长条件优化

2.2.1 不同碳源对Pseudomonas putida P10菌体生长和除磷能力的影响 选择柠檬酸钠、蔗糖、麦芽糖等11种常用碳源作为扩培培养基，将Pseudomonas putida P10接入扩培培养基中培养20 h，测定其菌浓及pH，并检测扩培后的菌体在合成废水中的除磷能力，见图2。当作为唯一碳源时菌浓最高（A600nm为3.55），其余10种则生长浓度较低，甲酸钠作为唯一碳源时扩培效果最差。 扩培结束时，生长较好的以柠檬酸钠碳源的发酵液呈碱性，pH值为9.31，在合成废水中磷含量下降5.28 mg/L，平均除磷速率是 11 mg/（g·h），为最大值；其余发酵液pH值均低于7，且接入合成废水后除磷能力较低。实验显示，柠檬酸钠有利于菌体的生长和后续的除磷，该实验结果与胡子全等人[13]研究认为不同碳源对菌体的生长和除磷效果有明显影响的观点是一致的。

2.2.2 不同初始pH对Pseudomonas putida P10生长和除磷能力的影响 将扩培培养基调整为不同pH值，接入Pseudomonas putida P10培养20 h，测定其菌浓及pH，并检测扩培后的菌体在合成废水中的除磷能力。由图3可以看出初始pH值对扩培有较大影响，当初始pH值在6-8时，发酵液菌浓较高且相当，在此区间内初始pH值对扩培影响不大，初始pH为6.5时发酵液菌浓最高（A600nm为3.44）；当初始pH值小于6或大于8时，扩培后发酵液菌浓较低。发酵液pH都有不同程度的上升。在合成废水中检测，当初始pH值在6～8时，磷去除量相当；初始pH为6时，在合成废水中磷含量下降到5.34 mg/L（即平均除磷速率为 11.13 mg/（g·h））；当初始 pH 值小于6或大于8时，除磷效果不佳。胡子全[13]和吴丽红等人[14]的研究亦认为适合的pH环境有利于菌体的生长和除磷。

图2 碳源对Pseudomonas putida P10生长和除磷能力的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on cell growth and phosphate removal

图3 不同初始pH对Pseudomonas putida P10生长和除磷能力的影响Fig.3 Effect of initial pH on cell growth of Pseudomonas putida P10 and phosphate removal

2.2.3 不同培养温度对Pseudomonas putida P10生长和除磷能力的影响 将菌体接入扩培培养基，在不同温度下培养20 h，测定其菌浓及pH，并检测扩培后的菌体在合成废水中的除磷能力，结果见图4。温度在30℃左右扩培效果较好，温度在31℃时，菌浓最高（A600nm为3.55）；这一实验结果与李博等人[10]研究的结果一致。温度低于25℃时对菌体生长不利，发酵液菌浓较低。温度对发酵液最终pH值影响不明显，均在8.09左右。在合成废水中检测菌体细胞的除磷能力，除磷量均在5.19～5.28 mg/L之间，最高值是扩培温度31℃时5.28 mg/L（即平均除磷速率为 11 mg/（g·h））。

图4 不同培养温度对Pseudomonas putida P10生长和除磷能力的影响Fig.4 Effect of different temperatures on cell growth of Pseudomonas putida P10 and phosphate removal

2.2.4 不同金属离子对Pseudomonas putida P10生长和除磷能力的影响 将菌体接入添加有不同金属离子的扩培培养基，培养20 h后测定其菌浓及pH，并检测扩培后的菌体在合成废水中的除磷能力。由图5可以看出铁离子、锰离子及铜离子对菌体生长有促进作用，其中铁离子效果最为明显，菌浓提高8.1% （对照A600nm为3.54）。其余金属离子的单独添加对菌体生长未起到明显的促进作用，有的甚至抑制菌体生长。当加入全部微量金属离子后，发酵液菌浓较CK提高了11.2%。培养结束后发酵液pH值无明显差别，均在8.05～8.20之间。在合成废水中检测菌体细胞的除磷能力，含铁离子培养基培养的菌体细胞和添加全部金属离子培养的菌体细胞对除磷能力的影响均不明显。此结果与李博等人[10]研究结果一致。

2.3 Pseudomonas putida P10除磷条件优化

2.3.1 不同初始pH对除磷效率的影响 将Pseudomonas putida P10接入不同pH值合成废水中，检测其除磷效率。由图6可以看出当初始pH值小于6或大于8时，除磷效果明显低于初始pH值在6～8；初始pH为6时，在合成废水中磷含量下降到 5.51 mg/L（即平均除磷速率为 11.48 mg/（g·h）），除磷效果最佳；pH值在6.5～8.0时除磷效果相近。较适合除磷的pH值范围与先进行扩培后再在合成废水中进行除磷的条件相似（图3）。培养后pH和菌浓（OD600）变化趋势相似，初始pH小于6时，培养后pH和菌浓均低于平均水平；初始pH大于等于6，培养后的pH及菌浓没有明显差别，均在8.1和0.6左右。

图5 不同金属离子对Pseudomonas putida P10生长和除磷能力的影响Fig.5 Effect of different metal ions on cell growth of Pseudomonas putida P10 and phosphate removal

图6 不同初始pH对除磷的影响Fig.6 Effect of pH on the efficiency of phosphorus removal by Pseudomonas putida P10

2.3.2 不同温度对除磷效率的影响 将菌体接入合成废水，在不同温度下培养20 h，测定其菌浓、pH及含磷量，由图7可以看出，在温度 31℃ 培养，除磷量最大，为5.14 mg/L（即平均除磷速率为10.07 mg/（g·h）），在温度 28 ℃ 培养，除磷量为 5.07 mg/L（即平均除磷速率为 10.56 mg/（g·h））， 可见除磷的最适温度在30℃左右，温度过高和过低均不利于磷的去除。随着温度的升高，合成废水中菌浓和pH值也随之略有升高。菌体生长和除磷状况随温度变化趋势较一致。

图7 不同温度对除磷的影响Fig.7 Effectoftemperature on the efficiency of phosphorus removal by Pseudomonas putida P10

2.3.3 金属离子对除磷效率的影响 将菌体接入添加有不同金属离子的合成废水中，培养8 h后测定其菌浓、pH及含磷量。由图8可以看出部分铁离子和锰离子对除磷有促进作用，其中铁离子效果最优，除磷量增加46.0%（CK对照组的除磷量3.63 mg/L，即平均除磷速率为 7.56 mg/（g·h））；添加锰离子除磷量增加11.1%。其余金属离子单独对菌体除磷未起到促进作用，甚至起抑制作用。当加入全部微量金属离子后，除磷量增加68.9%。培养结束合成废水pH值无明显差别，均在8.07～8.23之间。在合成废水中菌浓差别不大，A600nm在0.47～0.56之间。

图8 金属离子对除磷的影响Fig.8 Effect of metal ion on the efficiency of phosphorus removal by Pseudomonas putida P10

2.3.4 菌体对不同磷源的去除效率 合成废水中加入不同种类的磷源以检测菌对磷的去除效果。图9显示，菌对钾盐的去除效果比钠盐好，且对磷酸氢二钾中磷的去除效果最好（除磷量5.39 mg/L，即平均除磷速率为 11.23 mg/（g·h））。

图9 菌体对不同磷源的去除效果Fig.9 Effect of different phosphorus on the efficiency of phosphorus removal by Pseudomonas putida P10

3 结语

1）从江南大学环境工程实验室性能稳定的实验室规模A/O反应器沉淀池中的剩余污泥中分离出一株除磷性能较强的菌株Pseudomonas putida P10。

2）Pseudomonas putida P10的最适生长 pH和除磷初始pH分别为6.5和6.0；最适温度培养温度和除磷温度为30℃；铁离子、锰离子及铜离子对菌体生长起促进作用，铁离子、锰离子对除磷也起促进作用，其中铁离子作用最明显，可以提高菌浓8.1%，提高除磷量46.0%；

3）Pseudomonas putida P10对不同的磷源去除效果相差较大，菌体对以磷酸氢二钾状态存在的磷去除效果最好，平均除磷速率达到为 11.23 mg/（g·h）。

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