PCR及其衍生技术在乙肝病毒基因型检测中的应用进展＊

王连栓，孙玉杰，张海林（.大理学院公共卫生学院，云南大理 67000；2.云南省地方病防治所，云南大理 67000）

乙型肝炎病毒（HBV）是肝脏疾病的重要致病因子，是严重危害人类健康的病毒之一。目前，全世界HBV携带者约有3.8亿，而我国约有1.5亿人。HBV感染后临床表现呈多样性，可表现为无症状携带者、急性肝炎、重症肝炎或慢性肝炎，其中部分慢性肝炎可演变为肝硬化或肝癌。每年死于乙型肝炎相关性肝病约为50万人。根据HBV全基因序列异质性大于或等于8%的界线就可以定义为一个基因型标准，可将HBV分为A～H 8种基因型。但最近在日本和东南亚地区发现了不同于以往核酸序列的新基因型：I型和J型[1－2]。有研究证据显示肝病的转归，病情的进展等都与HBV基因型相关。Kato等[3]和Kobayashi等[4]的研究结果表明B基因型常表现温和的肝纤维化；C基因型易引起浸润性的严重肝脏疾病，并发展成为肝硬化和肝癌；而且C型HBV对干扰素治疗反应不敏感。Chu等[5]研究显示C型感染和肝炎复发也是发生肝硬化的独立风险预测因子。因此，早期、准确的HBV基因分型对肝病的诊断、治疗和病情的预测与转归有重要的指导意义。聚合酶链反应（PCR）技术是近几年快速发展起来的分子生物学检测技术，已广泛地应用于病原学检测、基因组研究领域。特别是以PCR技术为基础的相关技术的不断涌现，为HBV基因型的检测提供了有力的依据。为此作者对以PCR技术为基础的分子生物学检测方法在HBV基因分型中的应用进展作一综述。

1 实时荧光定量PCR（FQ－PCR）

FQ－PCR是一种实时定量分析技术，是利用TaqDNA聚合酶的5′－3′外切核酸酶活性，在扩增的同时降解杂交于扩增区域内的探针，使连接于杂交探针的荧光淬灭基团和荧光发射基团分离而产生荧光，因此荧光强度的变化能反映扩增产物量的变化。由于在扩增的每一个循环中均由计算机同步跟踪和直接探测扩增过程中产物量的变化，不需做扩增后产物的处理或检测，克服了扩增产物终点检测所存在的“平台效应”对产物定量的影响，减少了污染机会，因此本技术具有高度的特异性、灵敏度与准确性。目前，该技术已经广泛应用于病原体检测、肿瘤免疫、基因表达、基因组变异等方面。潘克女等[6]，设计2条荧光探针，对240例HBV感染者采用FQ－PCR技术进行基因型检测。结果基因B型82例，基因C型140例，基因B/C混合型15例，未知3例。同时应用全序列测序法对FQ－PCR检测出的B型、C型基因标本各10例进行检测验证，结果证实与实时荧光PCR法检测完全一致。由此认为FQ－PCR结果判断比较简单、省时、可靠，适合HBV基因型的流行病学调查。蒋新良[7]对36例乙型肝炎患者的血清分别采用荧光定量PCR技术、测序技术、恒温扩增技术和基因芯片技术进行HBV基因型的检测，实验结果表明荧光定量PCR技术特异性100%，敏感性83%，结论认为该技术虽然是目前最常用的技术，但也存在每次检测只能检出一种基因型的缺点。为建立一种快速准确的检测HBV基因型方法，孙余婕等[8]用实时荧光定量PCR方法对150例乙肝患者进行HBV－DNA定量检测和分型检测，并对其中的114例标本进行测序分型检测以验证所建立方法的准确性，结果HBV分型检测与HBV－DNA测序检测的114例样本中，只要是HBV B基因型、C基因型或B/C混合型，HBV基因分型检测都能检出来（共111例），总体符合率为100%。未能被本法检出的3例样本经测序分型均为D型。结论认为应用TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法能快速对HBV基因型B基因型、C基因型进行检测，结果准确可靠，特异性高。

2 巢式PCR

此种技术与一般PCR的区别在于用两对引物代替了1对引物对目标序列进行扩增。第1对PCR引物的扩增与标准PCR十分相似。不过，第2对引物被称为巢式引物的引物结合到第1轮PCR产物片段上后将引发第2轮的扩增，只是产物比第1轮的短。巢式PCR的优势在于，如果在第1轮扩增中出现了错误的扩增片段，在第2轮扩增中它再次被扩增的可能性非常小。因此该技术是一种特异性很强的PCR技术。Naito等[9]设计特异性引物并进行巢式PCR。首先用共用引物扩增S开放读码区，再用加入型特异性引物的混合物进行第2轮扩增，结果扩增出不同长度的核苷酸片段，成功地进行了HBV基因型分型。殷继明等[10]应用巢式PCR法，设计10条内外引物对276例HBV－DNA阳性标本进行基因分型检测，结果HBV基因型总检出率以C型为主，占76.8%，B型占21.7%，B和C混合型占1.5% ，未检出 A、D、E、F基因型。结论认为该方法简便易行、敏感性和特异性高，可用于HBV感染的流行病学调查。张于勤和崔鲂[11]应用多对型特异性引物巢式PCR方法检测15例慢性乙肝患者血清中HBV基因型，结果通过两轮PCR扩增后能直观地辨别出HBV的基因型，同时还发现有些血清样品第1轮扩增为阴性，但在第2轮呈阳性，表明此种技术的特异性较高，可减少假阴性和假阳性的发生。试验中还发现此种方法步骤较复杂，污染机会大，虽特异性高但无法避免出现非特异性扩增条带的出现。曹家麟等[12]应用型特异性引物巢式PCR对202例HBV－DNA阳性的慢性HBV感染者检测HBV的基因型，结果成功分型，B型37例，C型123例，B/C混合型41例，D型1例，并取B、C基因型的样本各2份，D基因型的样本1份进行测序分析，结果与型特异性引物巢式PCR法一致，表明该方法特异性高。同时也指出虽然该法特异性没有直接测序法高，但若能严格掌握实验条件也能获得满意结果。温志立和谭德明[13]应用多对型特异性引物巢式PCR方法检测了220例湖南籍慢性乙型肝炎血清中的HBV基因型，并与目前常用的PCR－RFLP法进行了比较，且同时做重复试验以证实该方法的可靠性和准确性，结果两种检测结果完全一致，重现率100%。因此结论认为这种巢式PCR分型法能清晰直观地辨别HBV基因型，结果准确、可靠。赖辉等[14]用该方法对80例 HBV－DNA阳性慢性 HBV感染者血清进行HBV基因分型，结果经两轮PCR扩增后成功分型，B型64例，C型12例，B/C混合基因型4例。试验中发现该方法操作简捷，只需进行PCR和电泳，结果清晰直观不易误判，对混合基因型的检测尤为有利。结论认为这种基因分型方法准确可靠，并有很高特异性。王林川等[15]为了建立一种适用于临床的HBV基因分型的方法，根据HBV基因型（AH）前S1到S基因的保守序列设计12条内外引物，应用该方法对360例乙型肝炎患者血清进行扩增，分型成功348例。有5例样本第1轮PCR为阴性，第2轮阳性，FQ－PCR测定HBV－DNA＜103copies/mL，经巢式PCR2轮扩增，最终判定为C基因型，提示对于HBV低浓度样本，巢式PCR优于FQPCR。因此认为此法具有简单快速、灵敏度高、特异性高的特点，适用于临床HBV基因分型检测。

3 限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR－RFLP）

PCR－RFLP基本原理是用PCR扩增HBV的S基因，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，最后通过不同的电泳图谱直接分型。此项技术不需对酶切产物进行杂交和测序，方法简便，分型时间短。国内彭亮和丁静娟[16]对149份乙肝患者血清用PCR－RFLP分型方法进行基因分型，并与多引物对PCR基因分型方法进行比较，结果发现PCRRFLP方法不仅在分型成功率、敏感度均优于后者，而且操作步骤简单，减少了污染机会 ，能够迅速准确地进行A－F各基因型分型，特异性强、灵敏度高，适用于大样本筛检及临床应用。为了验证PCR－RFLP方法在基因型分型中的准确性，阎丽等[17]用此方法鉴定验证30例经SPCR－PFLP方法已鉴定出的HBV B、C和D基因型标本，并随机其中各3株标本进行S基因测序证实。结果两种HBV基因型分型结果一致。由此认为PCR－RFLP方法能够准确鉴定HBV基因型，该方法灵敏性高，特异性强，适宜于HBV基因型的流行病学调查。

4 PCR－反向点杂交（PCR－RDB）

该方法将多种核酸检测探针固定在膜条上，通过与扩增后的待检靶序列杂交，一次即可进行多种基因亚型的分类，因此有很高的检测效率，而且简单经济。孔令和等[18]采用PCR－反向点杂交法，对203例HBV－DNA阳性患者HBV进行基因型分析。结果成功分型199例，其中B型160例，C型24例，B/C混合型14例，D型1例，结论认为该技术可以简便地对HBV进行基因型分析，分型成功率高，适用于临床检测。杨光等[19]也利用该技术对300份HBV－DNA阳性患者血清进行HBV基因分型检测，并与基因测序结果比较确定该方法的有效性。结果发现该方法可进行基因分型，并且基因分型结果与测序结果一致。由此认为逆向点杂交技术在进行HBV基因分型中具有，具有灵敏度高、特异性强、简便和经济的特点，适用于临床检测与流行病学研究。黄燕萍等[20]利用该技术检测21例慢性乙型肝炎患者，经对阳性患者血清标本PCR扩增，克隆后测序证实分别为不同的HBV基因型及YMDD变异型。结论认为该方法检测HBV基因型及YMDD变异，经济实惠、准确快捷，且易于开展。但同时指出本实验标本量少，需进一步的研究及检测更多的临床标本进行验证。

5 PCR微板核酸杂交－酶联免疫吸附试验（ELISA）

该方法首先用PCR扩增HBV－DNA，扩增产物加入包被HBV通用探针的微孔板后，再加入HBV各基因型显色探针，同时进行微板核酸夹心杂交－ELISA显色，从而确定基因型。此方法将基因扩增、核酸分子杂交和酶联免疫显色3种诊断技术融为一体，发挥了核酸分子杂交技术特异性高，PCR检测技术灵敏度高和酶联显色检测方便的优点，分型准确可靠。江秀梅[21]应用此方法对206例HBV－DNA阳性病例进行基因分型，结果B型104例，C型80例，混合型13例，D型9例，分型均获得成功。王虹等[22]运用该方法对152例乙型肝炎患者的HBV－DNA进行基因分型，结果B型43例、C型57例、D型28例；A型、E型、F型各有5例，同时还检测到B、C、D三型不同组合的混合型16例。因此认为PCR微板核酸杂交－ELISA方法在进行HBV基因分型中具有准确、快速、简便的优点，在观察各基因型致病性及HBV的流行病学研究方面有重要意义。

6 其他相关PCR技术

随着分子生物学技术的不断发展，以PCR技术为基础的相关技术越来越多的应用于HBV基因型的检测中。例如Chen[23]等设计了能在一个反应管内扩增A～F基因型的多重PCR方法。该法操作简便，结果易于判定，可检测出HBV的混合型感染，适用于大规模的流行病学调查，但其灵敏度和特异度还有待进一步提高。黄惠臣[24]根据A型、B型、C型设计引物，对110例HBV－DNA阳性乙肝病毒感染者进行基因分型，结果仅有7例未能分型，显示此PCR方法能将本地区绝大多数HBV进行定型。因此认为该方法较基因测序，基因芯片和RFLP分型方法操作简单、快速、可行。

7 结语与展望

HBV基因型与乙型肝炎患者的临床表现、治疗效果、预后与转归有着密切的关系，受到国内外学者越来越强烈的关注，其基因分型方法也随着分子生物学技术的不断进展而越来越多，但各种分型方法均或多或少地存在某些缺陷与不足，难以广泛应用于临床和流行病学调查。比如：基因序列测定法虽是公认的HBV基因分型的金标准，但不管是全序列还是S基因序列测定，均繁琐费时，费用较高，不适合临床检测和流行病学调查；基因型特异性表位单克隆抗体ELISA操作虽然简便，可对HBV的A～F基因型进行检测，但其准确性较PCR差，而且所检测的标本必须是HBV表面抗原阳性血清，对于混合型感染和HBV表面抗原低水平表达的标本可能无法鉴别；DNA芯片分析具有很高的灵敏性和特异性，可对核酸序列进行大规模、高通量的研究，但由于设备要求高，价格昂贵较少应用于临床。PCR技术是现代分子生物学研究中的一项革命性创举，操作简单，灵敏度高，特异性强，是公认的敏感和特异的检测方法，目前已广泛应用于基因克隆、检测、配型、遗传病的诊断、恶性肿瘤和法医学等领域。其衍生技术的发展，使PCR技术进一步完善，扩大了其应用范围，也广泛的用于HBV基因分型。但如同其他技术一样，该技术在HBV基因型分型中也存在着一些缺陷，比如型特异引物－PCR分型法虽然是一种比较成熟的基因分型方法，可应用于临床感染诊断和大规模的流行病学调查，但由于受个别核苷酸变异或病毒载量较低的影响，仍有5%～8%的HBV不能用该方法顺利分型；PCR－SSO基因分型法的优点是能检测所有基因型（A～H），可鉴别某些用直接测序不能区分的混合型感染，但也只能对已建立的基因型进行分型；PCR－RFLP分型方法因为操作简便，适用于流行病学调查研究，但它也存在遇到混合感染或酶切不完全时，会出现带型不清而导致结果判断困难的缺点；PCR微板核酸杂交酶联免疫分型法虽然综合运用了3种原理，特异性高，易于自动化，但杂交后需复杂的显色步骤，而且杂交背景也易受各种因素的干扰。尽管以PCR为基础的技术在HBV基因型分型中的应用还面临许多困难，但我们相信，随着分子生物学的操作技术不断发展与提高，PCR及衍生技术在HBV基因型分型中一定会操作更加简便，敏感和特异性更高，而且更适用于临床及流行病学的调查研究。

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