牙周膜干细胞的生物学特性及其作为种子细胞在牙周组织工程中应用的研究进展

殷丽华，刘 琪，余占海，秦子顺

（兰州大学口腔医学院修复科，甘肃 兰州 730000）

目前，用于牙周组织工程的种子细胞有牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）、牙髓基质干细胞、胚胎干细胞和脂肪干细胞等。其中PDLSCs因具有多向分化和自我更新的潜能，被认为是牙周组织工程的首选种子细胞。PDLSCs不仅能分化为成骨细胞样细胞和牙骨质细胞样细胞，形成骨样及牙骨质样组织；还可分化为成纤维样细胞，形成类似牙周韧带样的结缔组织形态，空间排列上类似于天然牙骨质牙周膜复合体的结构［1－4］。本文作者就近年来PDLSCs的生物特性、培养分离与纯化、适合PDLSCs作为种子细胞的牙周组织工程支架材料以及其在牙周组织工程中的应用等相关研究做简要综述。

1 PDLSCs的生物特性

1.1 高度的增殖特性 PDLSCs具有高增殖特性和集落形成能力，其在体外分离纯化并扩增，可传代20代以上，冻存后其相关性状不会出现改变［5］。Gay等［6］研究发现：PDLSCs在48h内与骨髓基质干细胞表现出相同的增长率，在96hPDLSCs数量几乎比骨髓基质干细胞增加1倍，而细胞生长的结果表明：PDLSCs的克隆能力优于骨髓间充质干细胞。此外，Park等［7］研究也发现：PDLSCs集落形成能力高于骨髓基质干细胞（6.0%和5.1%）。

1.2 自我更新能力 Yang等［8］将PDLSCs采用特殊的三维培养系统进行培养，并将培养的细胞移植到免疫缺陷鼠体内，组织学观察结果发现：移植区形成类似于牙本质－牙周膜样结构。此外，Liu等［9］将小型猪自体PDLSCs与羟基磷灰石／磷酸三钙支架复合后移植到人工制备的牙周病损区，与单纯支架组和空白对照组比较，PDLSCs与支架复合移植后有明显的骨、牙骨质和牙周韧带再生。这些研究均表明：PDLSCs移植后可以形成真正意义上的牙周膜、牙骨质和骨组织，证明了PDLSCs具有形成来源组织的自我更新能力。

1.3 多向分化潜能 PDLSCs具有很强的分化能力，可分化为多种细胞。最近的一项研究［1］表明：PDLSCs不仅拥有在体外分化为成牙骨质／成骨细胞和脂肪细胞的能力，还拥有体内牙周组织再生能力。此外，PDLSCs还可表现出类似成纤维细胞的形态并表达CD90、CD29、CD44和CD166，也被作为骨髓基质前体［10］。PDLSCs不同亚群分化能力也不同，Dons等［11］在实验中获取了PDLSCs的4个亚群，即C5、C6、C7和C8，其形态有所区别，功能也有所侧重，其中C7有较强的克隆和多分化潜能，而C5和C6具有较强的矿化潜能，C8则具有较强的成骨和成脂分化能力。

2 PDLSCs的培养、分离与纯化

2.1 PDLSCs的培养 PDLSCs主要取材于健康牙齿的牙周膜，通常来源于阻生的第3磨牙或因正畸需要拔除的前磨牙的根中1／3部位。常见的分离方法有3种：组织块法、酶联合消化法和酶解组织块法。Liu等［12］采用组织块贴壁培养的方式分离PDLSC，在组织块贴壁3～6d可见有细胞爬出，7～14d细胞密集生长。Yu等［13］应用胶原酶消化法分离人PDLSCs，在37℃条件下，用浓度为0.25%的Ⅰ型胶原酶对牙周膜进行消化，即可获得单细胞。此方法的细胞分离速度明显快于组织块贴壁法，但由于酶消化时间不易控制，若消化过度则会影响细胞活性。Shen等［14］将上述2种方法结合，所获得的细胞有较强的自身活性，克隆形成效率较高，并在成脂和成骨方面具有一定的潜能。

2.2 PDLSCs的分离与纯化 目前，常用于纯化PDLSCs的方法有：有限稀释单克隆纯化法、流式细胞术或免疫磁珠表面标记物分选法等。利用流式细胞术和免疫磁珠法分离PDLSCs，方法简单易行，获得PDLSCs的速度较快，但两者均需特殊的器械，费用较高，细胞克隆率不高［15］；而利用有限稀释法分离PDLSCs，方法较为繁琐，获得PDLSCs速度较慢，但不需要特殊的器械，且细胞克隆率高［11］。贺慧霞等［16］采用免疫磁珠法分离PDLSCs，制备细胞爬片；分别采用免疫荧光、免疫细胞化学染色法检测PDLSCs表面蛋白STRO－1、CD44、Vimentin、CK、COL－Ⅰ和BSP的表达。同时收集PDLSCs，采用RT－PCR法检测PDLSCs Sclera－xis、mRNA、ColⅠ及CAP mRNA的表达情况。结果显示：PDLSCs表达间充质干细胞表面标志STRO－1和CD44，强阳性表达间充质来源细胞表面蛋白Vimentin，弱表达Col－Ⅰ，不表达上皮细胞标志蛋白CK、成骨细胞相对特异性蛋白BSP。RT－PCR显示：PDLSCs表达韧带组织特异性基因Sclera－xis和Col－Ⅰ，不表达成牙骨质细胞特异性蛋白CAP。证明了PDLSCs具有间充质来源的、牙周组织特异性的、未分化细胞的表型特点，该特点可作为PDLSCs分离和鉴定的重要依据。

3 适合PDLSCs作为种子细胞的牙周组织工程支架材料

将体外培养扩增的PDLSCs单独植入机体或骨缺损内，细胞容易流失，不能在局部达到有效的细胞浓度，不能成骨，因此需要选择合适的细胞外基质作为支架。支架为细胞提供黏附的载体和生长繁殖的空间。理想的支架材料应满足下列条件［17］：良好的生物相容性、生物降解性和骨引导性，良好的细胞亲和性，良好的可操作性以利于塑形，良好的生物力学性能，具有类似无机骨的三维立体多孔结构。目前常用的支架材料类型主要有可降解聚合物生物材料、人工合成磷酸钙陶瓷类生物材料和天然衍生物材料等。

3.1 可降解聚合物生物材料 可降解聚合物生物材料，如聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）和乳酸／羟基乙酸共聚物（PLGA）等，He等［18］将分离的PDLSCs扩增后，分别接种到纳米羟基磷灰石／聚乳酸支架上和羟基磷灰石／磷酸三钙支架上，植入狗皮下，21d诱导成骨后，组织学观察结果显示：比较2组新骨形成，纳米羟基磷灰石／聚乳酸组高于羟基磷灰石／磷酸三钙组（P＜0.05）。这项研究结果表明：胶原基纳米骨／聚乳酸可以作为一种有效支架用于牙周组织再生。这类材料具有骨引导性和可吸收性，但亲水性不足，不利于细胞吸附，在降解过程中可引起机体局部的无菌性炎症［19－20］。

3.2 人工合成磷酸钙陶瓷类生物材料 磷酸钙陶瓷具有一定的溶解性，可通过溶解／沉积反应在骨的磷磺灰石和陶瓷表面所形成的相似的磷灰石之间提供化学结合；通过吸收／骨代替过程促进和支持了周围骨细胞的生物活动。但由于其只具有骨传导作用，而不具备骨诱导作用，目前只能用于相对较小的骨缺损修复，为新骨的形成提供支架［21－23］。张可夫等［22］等将多孔纳米磷酸钙陶瓷材料制成浸提液、混悬液、5mm×5mm块状等体系，选择健康新西兰兔、昆明小鼠、SD大鼠为宿主，采用溶血试验、凝血试验、急性毒性试验、热原试验和肌内降解对其生物相容性进行评价。结果显示：该陶瓷材料是一种安全无毒、无溶血性、对皮肤和肌肉无刺激作用、不含热原物质的组织工程支架材料，其生物相容性良好，适用于组织工程。

3.3 天然衍生物材料 天然的生物可降解材料及其衍生物包括珊瑚、羟基磷灰石、几丁质、壳聚糖、胶原、明胶、透明质酸和富血板血浆等。鲁红等［24－26］认为：纳米羟基磷灰石材料是良好的牙周组织工程支架材料，通过与PDLSCs形成细胞支架，成功地应用于牙周组织工程并获得良好的牙周组织再生和重建。Sionkowska等［27］将羟基磷灰石和胶原蛋白从动物筋腱中分离并用作不同比例的复合材料，并利用扫描电镜（SEM）、红外光谱（IR）、傅里叶变换衰减全反射红外谱（ATR）检测该复合物的微观结构特征，得到的三维复合材料胶原和纳米羟基磷灰石的形态特征良好，建议作为骨组织工程软的潜在用途支架。胶原蛋白海绵由于其形状、生物相容性、灵活性和亲和力的巨大优势，可能是优秀的骨移植支架的候选者。

4 PDLSCs作为种子细胞在牙周组织工程中的应用

牙周再生是牙周组织工程学的最终目的，因而利用PDLSCs的多向分化潜能修复牙周缺损成为近来研究的热点。常秀梅等［28］利用冻干胶原膜为支架，以犬PDLSCs为种子细胞，在体外构建组织工程化牙周膜。扫描电镜、透射电镜和苏木精伊红染色发现：细胞黏附在生物支架上，细胞增殖和生长良好，且分泌大量基质并形成纤维状结构，细胞复层生长，伸入膜的内部，增殖的细胞和分泌的基质与膜交接成一整体，复合物成为纤维网状组织，基本具备牙周膜的纤维状结构。Feng等［29］将人PDLSCs在3名牙周炎患者中进行自体移植，临床检查表明：移植的人PDLSCs可能提供治疗并有利于牙周缺陷的修复。所有接受治疗的患者在整个过程中未表现出不良影响。Kim等［30］将人PDLSCs分离、培养扩增后，植入免疫缺陷小鼠皮下，分别在3d、1周、2周、4周和8周后处死小鼠，组织病理和免疫组织化学染色观察牙周膜与牙周组织再生的组织特异性标记的顺序表达结果发现：在第1周首先发现胶原基质；第2周胶原基质开始形成纤维的定向排列，其中一些嵌入式成牙骨质样组织；第4周时，牙周膜样组织形成与前几个阶段比较变得更加活跃，随着时间的推移牙骨质样组织不断走向成熟和矿化；第8周后，牙骨质样细胞可能有再生的潜力。此研究为以细胞为基础的牙周疾病治疗提供了新的治疗模式。

5 展 望

随着牙周组织工程学的飞速发展，PDLSCs作为1种新发现的成体干细胞已经引起人们的高度关注。诸多研究表明：PDLSCs是牙周组织工程中最有潜力的一类种子细胞，该细胞的高度自我更新能力和多向分化潜能使其在临床应用上具有广泛的前景。目前，PDLSCs在牙周组织工程方面的应用研究已取得了一些进展，但这方面的研究工作在国内外均属起步和探索阶段，所以仍有许多亟待解决的问题：PDLSCs的培养分离、纯化方式仍无统一标准；动物研究中何种输注细胞途径最为安全有效；进行移植的准确时机等。因此，只有完善PDLSCs的一系列基础研究，建立安全可靠的临床应用模式，才能真正为PDLSCs用于牙周疾病患者的治疗提供新的思路和途径。

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