大肠埃希菌外排系统与多重耐药研究

陈伶利，李 杰

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

细菌耐药性是指细菌对抗菌药物的相对抗性。如果从弗莱明1929年发表《论青霉菌培养物的抗菌作用》论文算起，抗菌药物与病菌之间的“拉锯战”已有80年。人类为了对付层出不穷的致病微生物，不断研发出各类新型抗菌药物。而细菌为了生存，不断变异进化，形成可耐受多种抗菌药物的多重耐药细菌，典型的代表菌如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等[1]。细菌耐药性已成为21世纪全球关注的热点，我们主要对大肠埃希菌外排系统与多重耐药最新进展进行综述。

一、大肠埃希菌的耐药机制

细菌的耐药机制非常复杂，从遗传学角度来说，细菌的耐药分为固有性耐药和获得性耐药。前者来源于该细菌本身染色体上的耐药基因，代代相传，具有典型的种属特异性;而后者是由于细菌在生长繁殖过程中，其DNA发生改变而使其形成或获得了耐药性表型，介导DNA改变的因素包括染色体突变和质粒、转座子、整合子等介导的耐药基因的获得。一直以来，人们都认为细菌的耐药性是随着抗菌药物的使用而后天获得的一种能力，但是最新的研究表明，这种能力是先于现代抗菌药物选择压力之前细菌本身所固有的。来自加拿大麦克马斯特大学的研究人员在距今3万年以前的古细菌体内，首次发现了多种抗菌药物的耐药基因[2]。但耐药基因是如何转移的，还有待于研究。

细菌的耐药可由灭活酶或钝化酶的产生、细胞膜通透性的改变、药物作用靶位的改变、细菌自身代谢状态改变、细菌生物被膜的形成、多重药物外排机制等多因素引起。对于细菌来说，外排基因占所有转运蛋白基因的6% ～18%，所以外排基因编码的外排泵是导致其多重耐药的重要机制。如最新研究表明结核分枝杆菌对异烟肼和乙氨丁醇的耐受就是由一种药物外排基因jefA引起的[3]。而耐药菌株阴沟肠杆菌对喹诺酮的抗性也是由多药及毒性化合物外排家族(mutidrug and toxic compound extrusion，MATE)主动外排药物所介导[4]。对于大肠埃希菌来说，其表达的AcrABTolC外排泵更是被作为外排系统的经典模型来研究。研究结果也表明，临床分离的多重耐药的大肠埃希菌，其耐药性往往与某些基因的超表达相关，而这些基因是调控多重药物外排泵的转录因子，能上调多重药物外排泵AcrAB-TolC和下调膜蛋白的通透性[5-6]。所以，以下我们将详细介绍引起大肠埃希菌多重耐药的外排系统。

二、大肠埃希菌主动外排泵

细菌转运体系统相当复杂，从细菌转运体进化与功能角度来看，与抗菌药物耐药性有关的主动外排泵系统主要归为以下5个家族:三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)结合盒超家族(ATP-binding cassettes[ABC]transporters，ABC)、小多重耐药家族(small multidrug resistance，SMR)、主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)、MATE和耐药节结化细胞分化家族(resistance nodulation cell division，RND)[7]。以上各类转运体中，除ABC家族以ATP作为能源外排药物，MATE家族以钠离子或质子驱动力为能量外，其余各类均以质子驱动力为能量并形成质子与药物的反转运体，即质子与药物在转运过程中，质子进入胞内而药物被排至胞外。以下将对每个外排家族的功能进行介绍。

1.ABC ABC家族能介导一系列药物的外排。细菌中很多外排泵属于这一类型，如金黄色葡萄球菌的 AbcA、Sav1866，鼠伤寒沙门菌的MacAB，肺炎链球菌的PatA、PatB、SP2073/SP2075，结核分枝杆菌的 Rv0194、Rv1258C、Rv2686c、Rv2687c、Rv2688c等。对于大肠埃希菌来说，2005年Salomón带领的团队在其体内发现了一个属于 ABC 的外排泵——YojI[8]，虽然该外排泵的具体结构还不是很清楚，但研究结果表明，其与外膜蛋白TolC联合后可介导多肽类抗菌药物小菌素J25的外排[9]。亮氨酸应答调节蛋白能诱导YojI的表达，如果亮氨酸应答调节蛋白被抑制，则会导致YojI表达受阻。最近在嗜麦芽窄食单胞菌中发现一个ABC外排家族的新成员，命名为SmrA，该外排泵能增加大肠埃希菌对氟喹诺酮类、四环素、阿霉素及多种染料分子等物质的抗性，甚至还能减少大肠埃希菌对诺氟沙星的摄入及增加其外排[10]。

2.SMR SMR家族的成员超过250个，在这些外排成员中，有的是由染色体编码，如在鲍曼不动杆菌体内发现的AbeS[11]，也有的是由质粒编码。SMR主要外排一些杀毒剂以及氨基糖苷类抗菌药物。大肠埃希菌的EmrE是SMR的典型外排泵，其是一个由4个穿膜蛋白构成的同源二聚体并以此形式来发挥作用。虽然EmrE外排泵只能将其底物分子外排到其膜间隙，但其与AcrAB-TolC之类的RND外排泵联合作用仍然可以引起对底物分子的超强耐受性。在大肠埃希菌中还存在很多SMR外排泵如Mef(B)、QepA、QepA2等，他们都是由质粒编码的外排泵，前者可以外排一些重金属盐[12]，而后两者都能介导氟喹诺酮类药物的耐药[13-14]。

3.MFS 这也是一个很庞大的家族，细菌的很多外排泵都有此家族，包括鲍曼不动杆菌的SmvA、幽门螺杆菌的 Hp1181、枯草芽孢杆菌的Bmr和LmrB、金黄色葡萄球菌的 NorA和 QacA等。关于MFS的最新研究是在鲍曼不动杆菌体内发现了一个新的MFS外排家族成员AmvA，其能介导药物及杀菌剂的外排[15]。这些外排泵多数属于逆向转运蛋白单体，但在革兰阴性细菌中发现的MFS外排泵却属于由转运蛋白、膜融合蛋白和外膜蛋白共同组成的三联复合体，大肠埃希菌的EmrAB-TolC和EmrKY-TolC就是其中的典型代表。这种复合体转运机制比起单个转运蛋白对底物的转运效率要高一些，因为单个转运蛋白仅能将底物分子运送到膜的周质空间，然后再由别的外排泵转运出去。目前已有很多MFS转运体晶体结构已经非常清楚，如大肠埃希菌多重耐药外排泵EmrD，其能介导一系列疏水性分子的外排，如十二烷基磺酸钠、苯甲羟氨等。在霍乱弧菌体内也发现了EmrD-3外排泵，将该外排泵基因重组到大肠埃希菌体内能明显增加细胞对药物的耐受能力，其中对利奈唑酮的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations，MIC)值升高最明显，可达 102 倍(MIC=256 mg/mL)[16]。结构研究表明，在EmrD内部有一个由疏水残基构成的疏水性很强的结构，并向细胞内膜内侧伸出2个长环结构，该环能识别底物分子[17]。

4.MATE 这个家族能介导细菌对一系列包括氟喹诺酮类在内的阳离子毒性药物的耐受，但他的底物类型却比其他外排家族少很多。要通过质子或钠离子与药物的反向转运来提供能量。以副溶血性弧菌NorM外排泵为代表[18]，虽然目前报道的MATE家族成员大约只有20个，但是几乎在所有生物体内都存在MATE蛋白，如在人类染色体上就发现了编码MATE蛋白的基因hMATE1和 hMATE17，将hMATE1在HEK293细胞中表达后，能介导有机阳离子和质子的交换[19]。

5.RND RND外排家族是广泛分布在革兰阴性细菌体内的一类外排系统，其能主动外排抗菌药物和一些化学试剂。有研究显示RND的主动外排泵系统与细菌多重耐药性密切相关。大肠埃希菌中此家族包括7个 RND转运体，其中AcrAB、AcrEF、AcrD、YhiUV、MdtABC 与药物的排出有关，他们都需与外膜蛋白TolC联合，并通过TolC的开放外排不同的药物分子[20]。AcrABTolC外排系统是大肠埃希菌中最重要的外排系统，在大肠埃希菌的先天性耐药中起着显著的作用。近年来对他的结构和外排机制进行了深入的研究。AcrAB-TolC外排泵是由3个配体蛋白构成的三联体复合物，包括位于细胞内膜上的“输送器”(AcrB)、锚定在外膜上的“出口通道”(TolC)以及横跨周质空间的“转接蛋白AcrA”[21-22]。AcrA通过脂肪酸链连接在内膜上，并通过发卡结构连接在“出口导管”的双螺旋区域。他的作用主要是协调AcrB和TolC之间的相互作用，Tikhonova等[23]采用表面等离子体技术研究发现，AcrA上与细胞膜邻近的结构域部分的构象对AcrAB-TolC复合体的形成至关重要，并将作为新的抑制剂研发的靶点。内膜蛋白AcrB能识别外排药物，并通过构象改变形成质子和药物分子逆向转运的能量转化体[24]，他与药物分子具有很高的亲和性，其基因的突变会导致大肠埃希菌对邻氯青霉素MIC值下降512倍[25]。除此以外，AcrB还能与新生霉素、MC-207110等外排泵抑制剂结合，但此结合并不会影响其与AcrA、TolC的相互作用[23]。外膜蛋白TolC是位于外膜上的孔道蛋白，上端为开放结构，以便给外排底物提供泵出的宽阔通道;下端为封闭结构。三联复合物构象的改变，可使孔道定期开放或闭合。TolC错误的开放会引起他们三者相互作用的减弱甚至三联复合物的解体[26]。TolC除了在外排药物中发挥作用外，研究还发现其与大肠埃希菌耐受极酸性环境有关[26]。在对大肠埃希菌AcrAB-TolC的外排路径的研究中发现，AcrB识别药物分子，并引起其构象改变，形成一条药物分子进出的通道，AcrB构象的改变会带动 AcrA和TolC相互作用，开放TolC通道。DARPin能抑制AcrA与AcrB的相互作用，从而引起通道TolC错误的开放，使他们三者相互作用减弱甚至复合物的解体[23]。对于药物分子而言，他们先与 AcrB的“较低裂缝 ”部位结合，然后通过“结合口袋”运输到“通道大门”，最后到达连接AcrB与TolC的“漏斗部位”，经TolC通道排出细胞[27]。

三、展望

大肠埃希菌是重要的条件致病菌，其外排系统在其多重耐药中起到非常重要的作用。在过去10多年中，人们主要对大肠埃希菌外排泵的结构和功能进行了研究。随着研究的深入，新外排泵不断被开发，外排泵的结构不断被破解，这对解决日益严重的耐药问题具有重要的意义。在这些研究中，很少有针对外排泵分子机制的研究，如果更多地关注外排泵的三维结构、外排泵-底物复合物的合成以及动力学特征的研究，将有助于选择外排机制中的新目标，从而开发出具有临床意义的耐药性抑制剂。

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