核苷类化合物含量测定方法的研究进展*

2013-02-15朱静毅

天津药学 2013年6期

李　静，朱静毅

(扬州市药品检验所，扬州　225009)

核苷类化合物包括腺嘌呤、腺苷、3-脱氧腺苷(虫草素)、尿嘧啶、尿苷、鸟嘌呤、鸟苷、次黄嘌呤、胸嘧啶、胞苷等等。研究发现[1,2]核苷类化学成分对人体免疫、代谢以及肝脏、心血管及神经系统等发挥着重要的生理作用，且具有抗菌和抗病毒等生理活性，尤以腺苷的药理作用最为明显[3]，如腺苷具有改善心脑血液循环、防止心律失常、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等。

核苷类化合物广泛存在于冬虫夏草、板蓝根、灵芝等中药材中，因其通常是中药活性成分，故核苷类化学成分的含量可以作为中药材的质量控制指标。例如腺苷已被用作冬虫夏草的质控指标，《中国药典》 2010年版把腺苷定为发酵虫草菌粉的含量测定项目，规定虫草含腺苷不得少于0.010%。为此本文对核苷类化合物的含量测定方法做一综述，为今后核苷类化合物的研究提供参考。

1　HPLC法

高效液相色谱(HPLC)是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。该方法因其高效、高灵敏度、分析速度快的特点被广泛应用于医药、化学、农学等研究领域。根据检测器的不同，可分为HPLC-UV法、HPLC-DAD法和HPLC-MS法。

1.1HPLC-UV法在已经报道的HPLC法测定核苷类化合物含量的文献中，最常见的就是使用普通紫外检测器检测。根据流动相的洗脱方法不同可分为等度洗脱和梯度洗脱。

1.1.1等度洗脱应用等度洗脱法进行HPLC测定核苷类化合物含量的文献报道较多。

王棘等[4]采用十八烷基键合硅胶色谱柱，以磷酸盐缓冲液(pH 7.8-8.0) -乙腈(83∶17)为流动相，检测波长260 nm，测定了尿苷、腺苷、次黄嘌呤核苷的含量。姚静倩等[5]采用Lichrosper-C18柱，以水为流动相洗脱，检测波长254 nm，测定了三角帆蚌中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷和胸腺嘧啶的含量，且方法简便又经济环保。王梦月等[6]应用Waters C18反相色谱柱，检测波长260 nm，流动相0.05 mol/L KH2PO4-乙腈(97∶3)，同时测定了海龙中胸腺嘧啶、次黄嘌呤、尿嘧啶3种核苷类成分。为取得较理想分离效果，本实验比较了不同比例的甲醇-水和乙腈-水的分离效果，发现乙腈-水(3∶97)效果较好，但总体分离效果仍不理想，为此考查了向流动相中加入醋酸、三氟乙酸、四氢呋喃、磷酸二氢钾后的分离效果，发现加入磷酸二氢钾较理想。因此，最终确定流动相0.05 mol/L KH2PO4-乙腈(97∶ 3)。

周惠燕等[7]研究发现，核苷类化合物的含量测定主要使用两种流动相系统：一种为含磷酸盐缓冲液的流动相，一种为不含磷酸盐缓冲液的流动相。其中，核苷类化合物在含磷酸盐缓冲液的流动相中分离时间较短，保留时间基本在10 min左右，但在测定多个核苷类化合物时，和杂质分离度不够高；而在不含磷酸盐缓冲液的流动相中分离时间较长，保留时间较长，为25～40 min，峰形易扩散，但是分离度很好，且因为不含盐，减少了对色谱柱的损伤。

1.1.2梯度洗脱在液相色谱中，对组分复杂的样品，当采用等度洗脱时，常常出现各峰分离度较差，或峰完全分离时间过长的问题；而使用梯度洗脱时既可缩短分离时间，提高分离能力，又能改善峰型，增加灵敏度，是一种较好的流动相系统。

张元杰等[8]采用Zorbax SB-Aq分析柱；流动相为0.05%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～12 min，0%B；12～17 min，0%B→2%B；17～27 min，2%B；27～45 min，2%B→20%B)，流速0.5 ml/ min；检测波长260 nm。在此条件下，成功分析了尿苷、鸟苷、腺苷、腺嘌呤4个核甘类化学成分在6种常用补益中药人参、黄芪、熟地黄、当归、麦冬和肉苁蓉中的含量。张建芝等[9]采用甲醇-5 mmol/L乙酸铵-乙酸缓冲盐(pH=4.30)作为流动相，以1 ml/ min的流速进行梯度洗脱(洗脱梯度程序为：0～10 min，0%→l%A；10～20 min，1%→5%A；20～25 min，5%A； 25～35 min，5%→30%A；35～37 min，30%→0%A；37～40 min，0%A )，同时测定了贝母药材中尿苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷等5种核苷类化合物。

1.2HPLC-DAD法液相色谱法分析核苷类化合物一般采用紫外检测器，以保留时间定性。但对于成分复杂的样品来说，不同的物质可能在同一时间或极相近的时间出峰，仅靠保留时间定性可能会造成分析错误。而应用二极管阵列检测器(DAD)可以在线扫描样品的光谱图，鉴定色谱峰的纯度，分辨重叠峰，得到各组分的纯色谱和光谱曲线，从而根据组分的保留时间和光谱两方面信息，用于定性及定量。

张海娟等[10]采用Agilent Zorbax Bonux-RP C18色谱柱，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱。通过暗紫贝母样品峰的光谱图与混合对照品的光谱图比较，鉴别并定量测定了暗紫贝母中尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷、肌苷、腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶等10个核苷类化合物的含量，方法简单，重复性好，准确可靠。陈钢等[11]采用Waters高效液相色谱仪，应用Waters 2696二极管阵列检测器，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，测定了半夏中鸟苷、尿苷的含量，并建立了半夏药材的指纹图谱。该方法简单、快速、准确，可作为半夏质量控制的方法。

1.3液质联用(HPLC-MS)法液质联用又叫液相色谱-质谱联用技术，其以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统。样品在流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱与质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力与质谱高选择性、高灵敏度及可提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析和食品分析等领域得到广泛应用。

周菊峰等[12]采用以下质谱检测条件：电喷雾离子化(ESI)；正离子；选择性离子检测m/z，腺嘌呤136[M+H]+，腺苷268[M+H]+；虫草素252[M+H]+；2-氯腺苷(内标，IS) 302[M+H]+。ESI源温度380 ℃；脱溶剂和加热块温度分别为250 ℃和200 ℃；源电压+4.0 kV；检测电压1.5 kV；脱溶剂电压-18 V；Q-阵列偏转电压45 V，雾化气(N2)，分别建立了腺嘌呤、腺苷、虫草素的线性回归方程，同时快速测定冬虫夏草中腺嘌呤、腺苷和虫草素含量的方法。该方法灵敏、快速、选择性较好。黄兰芳[13]采用HPLC-ESI-MS法，选择性离子检测，建立了冬虫夏草及其代用品中虫草素的测定方法。经考查，该方法简便易行，结果准确，重现性好，可适用于测定冬虫夏草及其代用品中虫草素的含量和质量评价。

2　毛细管电泳法

毛细管电泳技术(CE)是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离技术。CE具有分离效率高、分析速度快、样品及溶剂消耗量小、分离模式多等优点，广泛用于生物及医药领域。而毛细管区带电泳(CZE)和胶束电动毛细管电泳(MEKC)是两种最常用的毛细管电泳分离模式。将CE与MS联用可以提高检测的灵敏度与选择性，获得大量的结构信息，更适合复杂基质中多种核苷类成分的分析。

祝玲等[14]应用毛细管区带电泳法，通过优化缓冲体系、缓冲溶液浓度、酸度及分离电压等实验条件，最后采用20 mmol/L硼砂-15 mmol/L环糊精为缓冲溶液(pH 9.4)，分离电压为22 kV，检测波长为254 nm，在10 min内同时分离测定了冬虫夏草菌丝体粉及鹿茸血制品中虫草素、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、腺苷、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷和肌苷等9种核苷，方法经济、简单、快速。郑育芳等[15]应用胶束电动毛细管法，通过苯基硼酸亲和色谱柱对尿中核苷进行纯化，以十二烷基磺酸钠-十水合四硼酸钠-磷酸二氢钠为缓冲液(pH 6.96)，在未涂层石英毛细柱上，于7kV 恒压，29 ℃下进行电泳分离，检测波长为254 nm，定性并定量测定了28个正常人尿中14种核苷，适合于监测癌症病人尿中核苷浓度的变化。

史倩等[16]分别以四硼酸钠、磷酸氢二钠、乙酸钠、碳酸氢钠、乙酸铵和乙二胺为背景电解质，对毛细管区带电泳、毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱以及胶束电动毛细管电泳3种模式进行比较，并优化了不同的缓冲液体系。结果发现，毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱分析中，以20 mmol/L乙酸铵(pH 10.0)为背景电解质，正离子模式检测，15种核苷类化合物的质谱信号均良好，检测灵敏度明显优于文献中报道的使用乙二胺缓冲体系的结果。由于质谱检测器能够获得丰富的结构信息，这种方法在天然食物、食品、尿液、血液等复杂基质样品中核苷类化学成分的分析领域具有广阔的应用前景。

3　薄层色谱扫描法

薄层色谱扫描(TLCS)法具有快速、经济可靠、操作简单、分离效果较好、时间较短等优点，是一种重要的分析分离手段与方法。其既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备，尤其适用于中药材中复杂天然物的组分分离及定性、定量分析，被广泛应用于医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域。

马艳等[17]采用以0.4%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板，以氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-水-氨水( 8∶ 2∶ 6∶ 0.5∶ 0.12)为展开剂，双波长反射法锯齿扫描，测定波长为254 nm，参比波长为300 nm，建立以双波长薄层扫描法测定虫草类制剂中核苷类化合物含量的方法。赵雪梅等[18]采用80%乙醇分别超声提取泰山虫草菌丝体和天然冬虫夏草，在GF 254硅胶板上点样后，以薄层色谱扫描法测定腺苷、尿苷、次黄嘌呤核苷、虫草素及次黄嘌呤等成分的含量。该方法简捷快速，重现性、稳定性良好，能有效地对泰山虫草菌丝体及冬虫夏草中有效成分进行定性定量分析。

4　紫外可见分光光度法

分子吸收波长范围在200～400 nm区间的电磁波产生的吸收光谱称为紫外吸收光谱，简称紫外光谱(UV)。紫外分光光度法则是根据物质分子的这一吸收特性建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。

李泳等[19]先利用紫外可见分光光度计进行标准测定，以拟定标准回归公式，再将提取样品利用分光光度计检测。结果得出虫草素的最大吸收波长为259 nm，虫草素吸光度与虫草素浓度间的标准回归方程为Y=65.5143X+0.0386(R2=0.9801)，结合回归系数从而获得经验公式：虫草素的浓度C(mol/L)=0.0153×A，并且利用该方法测定了几种提取样品的虫草素含量。

5　结语

综上所述，近年来核苷类化合物含量测定的常用方法主要包括HPLC-UV法、HPLC-DAD法、HPLC-MS法、毛细管电泳法、薄层色谱扫描法、紫外可见分光光度法，这些方法各有特点。高效液相不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，应用范围较广；缺点是样品分析时间长、色谱柱易污染、分析运营成本高。在HPLC法中，如选用MS检测器，方法的专属性强，灵敏度高、选择性好，但是检测设备昂贵。毛细管电泳法的特点是样品预处理简单，同时可测定多个成分的含量，较HPLC法简便、快速。薄层色谱扫描法和紫外可见分光光度法的特点是仪器设备要求低，操作简便，但方法的灵敏度和重现性差。

由于核苷类化合物特殊的药理活性，在医药领域受到越来越多的重视。发展快速、简便、灵敏、准确的含量测定方法是研究开发和应用核苷类化合物的基础，有待进一步研究。

1张雪梅, 杨丰庆, 夏之宁. 食品中核苷类成分的药理作用研究进展[J]. 食品科学, 2012, 33(9): 277

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3王丽凤, 郑延松. 腺苷在心血管疾病中的应用[J]. 中华现代临床医学杂志, 2005, 3(15): 1518

4王棘, 毕开顺. HPLC测定宁心宝胶囊中核苷类化合物含量[J]. 中成药, 2008, 30(4): 537

5姚静倩, 昊皓, 王令充, 等. HPLC测定三角帆蚌中主要核苷类成分的含量[J]. 中国海洋药物杂志, 2009, 28(4): 31

6王梦月, 韦静斐, 史海明, 等. HPLC法测定海龙中胸腺嘧啶、次黄嘌呤、尿嘧啶的含量[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(17): 2277

7周惠燕, 陈钰, 许丽丽. 冬虫夏草中核苷类化学成分的含量测定研究进展[J]. 中成药, 2011, 33(11): 1955

8张元杰, 钱正明, 陈肖家, 等. HPLC法同时测定补益中药中尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的含量[J]. 药物分析杂志, 2010, 30(1): 33

9张建芝, 宋昌慧, 陈波, 等. RP-HPLC同时测定贝母药材中5种核苷类化合物[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(1): 67

10张海娟, 马世震, 肖远灿, 等. RP-HPLC同时测定暗紫贝母中10个核苷及碱基类成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(6): 986

11陈钢, 崔小兵, 谈献和, 等. 半夏药材中鸟苷和尿苷的含量测定及半夏指纹图谱研究[J].西北药学杂志, 2011, 26(5): 313