miR－26a－1 rs7372209基因多态性与冠心病遗传易感的关系

成 捷 岑锦明 杨希立 荆 霞 刘新光 熊兴东 (广东医学院衰老研究所，广东 东莞 5808)

miR－26a－1 rs7372209基因多态性与冠心病遗传易感的关系

成 捷1岑锦明2杨希立2荆 霞3刘新光1熊兴东1(广东医学院衰老研究所，广东 东莞 523808)

目的研究miR-26a-1 rs7372209基因型和等位基因频率分布，探讨miR-26a-1 rs7372209基因多态性与华南地区汉族人冠心病遗传易感的关系。方法利用聚合酶链式反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)分析技术，对295例冠心病患者和283名对照个体的miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态位点进行分型，采用非条件逻辑回归分析统计该多态位点与冠心病易感的相关性。结果CC、CT、TT基因型在冠心病组中的分布频率分别为54.6%、37.6%和7.8%，在对照组中分别是57.2%、37.5%和5.3%，两组间基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=1.554，P=0.460)。携带miR-26a-1 rs7372209 T变异等位基因与冠心病的遗传易感无明显相关(OR=1.15，95%CI=0.88～1.49，P=0.315)。结论miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态位点与华南地区汉族人冠心病易感无相关性。

miR-26a-1;单核苷酸多态性;冠心病;遗传易感性

冠心病的危险因素除了常见的高血脂、高血压、糖尿病和吸烟等外，人们逐渐认识到遗传背景对冠心病的发生与发展也起到重要的作用〔1〕。而单核苷酸多态性(SNP)是影响个体对疾病易感的重要遗传因素。研究表明，miR-26a-1 rs7372209多态位点与非小细胞肺癌、结肠癌、膀胱癌和口腔黏膜癌前病变的遗 传易感 密 切 相 关〔2～5〕。迄 今 为 止，有 关 miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态与冠心病的遗传易感性尚未见报道。为阐明miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态对冠心病遗传易感的影响，本研究采用聚合酶链式反应-连接酶检测反应(PCRLDR)技术检测miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态基因型在华南地区冠心病患者及对照人群中的发生频率，探讨miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态位点与冠心病遗传易感性的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 包括283例对照组人群和295例冠心病患者的病例组。患者样本随机收集自2011年3月至2012年2月在佛山市第一人民医院治疗，并且经冠状动脉造影等检查确诊为冠心病的患者。冠心病诊断标准参照国际心脏病学会及WHO临床命名《缺血性心脏病的命名及诊断标准》，冠状动脉造影时显示主要动脉中至少有1支内径狭窄＞50%。对照组是经心脏ECT(心脏核素扫描)、冠脉CTA(CT冠脉成像)或冠状动脉造影等检查排除冠心病的个体。所有冠心病患者和正常对照个体均为无血缘关系的华南地区汉族人群，排除先天性心脏病、心肌病、严重肝脏和肾脏疾病。每例标本都具备年龄、性别、有无吸烟、有无喝酒、收缩压和舒张压、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、冠心病家族史等资料。在标本采集过程中，所有入选个体在入选时均告知其研究方法及其意义，做到知情同意。本研究得到了佛山市第一人民医院医学伦理委员会的批准。

1.2 实验耗材与设备 TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒(TianGen)，Taq DNA聚合酶和DL2000TMDNA Marker(Taka-ra)，Mastercycler®ep PCR 仪(Eppendorf)，ABI PRISM 377 DNA测序电泳仪(ABI)。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA抽提 每份样品均取静脉血2 ml，EDTAK2抗凝，按照TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒说明抽提外周血基因组DNA。－80℃保存备用。

1.3.2 基因分型 采用PCR-LDR方法对miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态进行基因分型。①rs7372209多态的引物和探针:引物和探针由上海翼和应用生物技术有限公司设计并合成。引物序列:上游:5'TTTGCAAAAGCATCAACTGAA3'，下游:5'ATATCACAGCACAGCCAGGA3'。探针序列:rs7372209(C＞T)_FAM 探针:5'AAGGATTAATTTCTCTCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3';rs7372209(C＞T)_C探针:5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATGCTTACAGTCACGTGGTACG3';rs7372209(C＞T)_T探针:5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATGCTTACAGTCACGTGG TACA3';② PCR 反应体系20 μl，基因组 DNA 1 μl，dNTP 2 μl，引物各0.5μl，10×PCR缓冲液2μl，Taq DNA 聚合酶0.5μl;PCR反应程序:95℃预变性15 min，然后94℃变性30 s，59℃退火1 min 30 s，72℃延伸 1 min，共 35次循环，最后 72℃延伸10 min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察PCR产物的效果，扩增目标片段长度为249 bp，确定其作为模板在LDR反应中加入的量。③LDR反应体系10μl，特异性探针1μl，PCR产物1μl，缓冲液1μl，连接酶0.05μl;LDR反应程序:95℃ 2 min，然后94℃变性15 s，50℃反应25 s，共30次循环。LDR片段长度分别为102 bp，104 bp。④产物经ABI 377电泳测序，结果运用GeneMapper 4.0软件进行数据分析。

1.4 统计学方法 利用goodness-of-fitχ2检验多态位点的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡;冠心病组和对照组中连续性变量资料采用t检验进行统计分析，分类变量资料采用χ2检验分析。Pearsonχ2检验比较冠心病患者与对照组的基因型分布差异;非条件逻辑回归计算比值比(OR)及其95%置信区间(CI)，分析基因型与冠心病发病风险的关系。所用统计软件为SPSS13.0软件。

2 结果

2.1 冠心病组和对照组一般情况的比较 该研究入选对象的性别和HDL-C在冠心病组和对照组中无显著差异。但收缩压、舒张压、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、LDL-C、冠心病家族史、饮酒、吸烟指数中冠心病组显著高于对照组，提示高血压、高血脂、吸烟、喝酒等是我国人群罹患冠心病的主要风险因素(表1)。

2.2 miR-26a-1 rs7372209(C＞T)基因型的分布及Hardy-Weinberg平衡检验 在所调查的人群中可检出rs7372209的3种基因型为CC型、CT型、TT型。纯合子的LDR探针扩增测序图谱为单峰，杂合子的测序图谱为双峰，见图1。采用双盲法随机抽取10%正常对照和冠心病标本进行PCR-LDR重复验证，结果显示测序结果100%一致。miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态的基因型分布频率在华南地区对照人群中分别为57.2%(CC)、37.5%(CT)和5.3%(TT)。Goodness-of-fitχ2检验表明miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态位点在对照组中符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.663)，表明本研究人群具有群体代表性，该人群的miR-26a-1 rs7372209基因型分布可反映整体人群基因型的分布情况。

2.3 miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态与冠心病遗传易感的关系 CC、CT、TT基因型在冠心病组中的分布频率分别为54.6%、37.6%和7.8%，在对照组中分别是57.2%、37.5%和5.3%，两组间基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=1.554，P=0.460)。非条件逻辑回归分析发现，以CC基因型作参照，CT基因型和TT基因型分别与其比较，均与冠心病易感无相关性(OR值分别为1.05和1.54，95%CI分别为0.75～1.49和0.78～3.06)。等位基因分析结果也显示，携带 miR-26a-1 rs7372209 T变异等位基因与冠心病的遗传易感无明显相关(OR=1.5，95%CI=0.88 ～1.49，P=0.315)。此外，对年龄、性别、吸烟和冠心病史进行分层分析，均未发现有意义的结果。

图1 m iR-26a-1 rs7372209 C＞T多态LDR分型结果图

表1 冠心病组和对照组人群的临床特征分析(±s)

表1 冠心病组和对照组人群的临床特征分析(±s)

临床资料 对照组(n=283)冠心病组(n=295)P值62.59±12.89 65.13±11.86 0.014性别〔n(%)〕 男 170(60.1) 195(66.1) 0.133女 113(39.9) 100(33.9)吸烟〔n(%)〕 无 198(70.0) 111(37.6) ＜0.001有 85(30.0) 184(62.4)喝酒〔n(%)〕 无 264(93.3) 210(71.2) ＜0.001有 19(6.7) 85(28.8)收缩压(mmHg) 137.25±14.90 144.96±15.53 ＜0.001舒张压(mmHg) 73.99±8.35 78.79±8.28 ＜0.001 FPG(mmol/L) 5.82±1.05 6.65±1.23 ＜0.001 TG(mmol/L) 1.48±0.71 2.19±1.07 ＜0.001 TC(mmol/L) 4.59±1.14 4.87±1.21 0.002 LDL-C(mmol/L) 2.75±0.77 3.09±0.82 ＜0.001 HDL-C(mmol/L) 1.21±0.32 1.25±0.37 0.159冠心病家族史〔n(%)〕无 280(98.9) 235(79.7) ＜0.001有 3(1.1) 60(20.3)年龄(岁)

3 讨论

越来越多的研究表明，包括SNPs在内的遗传因素在冠心病的发生发展过程中发挥重要作用，而miRNAs在心脏发育，心肌肥厚，心律失常，血管生成，血管内膜损伤及动脉粥样硬化斑块形成和不稳定等过程中发挥重要的作用〔6，7〕。本文提示miRNAs的基因多态性可能与冠心病的遗传易感性密切相关。

有研究表明，miR-26a-1 rs7372209多态位点在非小细胞肺癌，结肠癌，膀胱癌和口腔黏膜癌前病变的发生过程中发挥重要角色，例如，miR-26a-1 rs7372209多态位点可使女性膀胱癌的发病风险降低64%〔4〕，但使口腔黏膜癌前病变的发病风险升高2倍〔5〕。研究提示miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态与华南地区冠心病的发生没有相关性。此外，对年龄、性别、吸烟和冠心病史进行分层分析，也均未发现有意义的结果，该结果进一步说明miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多态与这些冠心病发生的重要因素无关，这也可能是它不影响个体患冠心病发病风险的原因之一。冠心病是多因素疾病，不同遗传背景和不同的环境危险因素对冠心病的发生有着重要的影响。因此，对于miR-26a-1 rs7372209(C＞T)基因多态性与冠心病的关系，仍需要在不同人种、不同的民族和不同的环境危险因素的作用下，探讨该多态位点对冠心病发病风险的影响。

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Relationship between m iR-26a-1 rs7372209 polymorphism and the genetic susceptibility of coronary artery disease

CHENG Jie，CEN Jin-M ing，YANG Xi-Li，et al.
Institute of Aging Research，Guangdong M edical College，Dongguan 523808，Guangdong，China

ObjectiveTo investigate the distribution ofgenotypes and alleles ofmiR-26a-1 rs7372209 polymorphism，and the correlation between this polymorphism and the genetic susceptibility of coronary artery disease(CAD)in the Han nationality of Southern China.MethodsThe genotypes of themiR-26a-1 rs7372209(C＞T)polymorphism were determined in 295 CAD patients and 283 control blood donors by polymerase chain reaction-ligase detection reaction(PCR-LDR).Association between the polymorphism and the risk for CAD was evaluated using unconditional logistic regression analysis.ResultsThe frequency of CC，CT and TT genotypes in the case subjects were 54.6%，37.6%and 7.8%respectively and in the control subjectswere57.2%，37.5%and 5.3%.No significantdifferencewas observed in the frequency ofmiR-26a-1 genotypes between cases and controls(χ2=1.554，P=0.460).Moreover，no significantly increased risk for CAD was observed for those carrying T variant allele(OR =1.15，95%CI=0.88 ～ 1.49，P=0.315).ConclusionsmiR-26a-1 rs7372209(C＞T)polymorphism is not associated with CAD in the Han nationality of Southern China.

miR-26a-1;Single nucleotide polymorphism;Coronary artery disease;Genetic susceptibility

R349.3

A

1005-9202(2013)12-2737-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.001

国家自然科学基金(No.81000143，81170327);广东省自然科学基金(No.S2011010002922);东莞市科技计划医疗卫生类重点项目(No.2011105102007);广东省卫生厅科研基金(No.A2011431，B2009191);广东医学院科技创新基金(No.STIF201102)

1 广东医学院生物化学与分子生物学教研室

2 佛山市第一人民医院 3 广东省医学分子诊断重点实验室

熊兴东(1978-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事衰老及老年性疾病的分子机制研究。

成 捷(1988-)，女，在读硕士，主要从事衰老及老年性疾病的分子机制研究。

〔2012-09-19收稿 2013-01-12修回〕

(编辑 曹梦园)