HPLC法同时检测肉制品中9种防腐剂和甜味剂

关丽丽，夏文娟，卢志晓，高源，李彦，梁君妮，沙美兰，牟妍，曹鹏，*

（1.烟台出入境检验检疫局，山东烟台264000；2.张裕集团有限公司白兰地分公司，山东烟台264000；3.日照出入境检验检疫局，山东日照276826）

甜味剂和防腐剂作为一类重要的食品添加剂被广泛用于食品生产加工，这类食品添加剂本身不能向人体提供营养物质。在我国食品卫生管理办法中，目前国家批准使用的食品添加剂种类很多，其用量也有严格规定[1]，但是部分不法食品生产者经营者出于赢利等目的，在食品中超范围或超限量使用食品添加剂。甜味剂（糖精钠等）和防腐剂（山梨酸、苯甲酸等）在市场上已有滥用的趋势，给食品安全带来隐患，对消费者的健康造成直接的威胁[2]。对羟基苯甲酸酯类是新一代高效低毒消毒杀菌防腐剂，相比于苯甲酸和山梨酸及其盐类，此类物质的抗菌能力强，应用的pH 范围广，用量低，并且使用安全，经济方便，对人体刺激较小。但Roufledge 等[3]发现对羟基苯甲酸酯具有弱雌激素活性，这一发现对原有的对羟基苯甲酸酯低毒性的观点提出了挑战。欧盟明确规定：以对羟基苯甲酸计，食品中对羟基苯甲酸酯的最高允许含量为0.1%，当几种对羟基苯甲酸酯复配使用时，其总量不得超过0.1%。

现用于检测食品中添加剂的检测方法主要有高效液相色谱法[4-7]、高效液相色谱-质谱法[8]、气相色谱法[9-13]及气相色谱-质谱法[14]等。气相色谱法存在样品前处理步骤繁琐、灵敏度不高的弱点，而现有的高效液相色谱法存在检测种类少的问题。同时现有方法测定的基质多为饮料等[15]，对于猪肉及熏煮香肠中防腐剂和甜味剂的检测却鲜有报道，而且没有山梨酸、苯甲酸等防腐剂同对羟基苯甲酸酯一起检测的方法。因此本研究为提高工作效率，更好地适应食品检测分析工作的需求和发展趋势，采用高效液相色谱法同时测定了猪肉中及熏煮香肠中的9 种甜味剂和防腐剂，样品前处理简单，检测结果准确可靠。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Aglient 1100 高效液相色谱仪配有二级管阵列检测器（DAD）：美国安捷伦；Rios8 milli-QG 超纯水仪：美国密理博；ZJ000832 电子天平（精确至0.01 g）：长沙湘平科技发展有限公司；VORTEX-2 GENIE 漩涡混合器：Scientific Industries；KQ-500E 超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；CF16RXⅡ离心机：日本HITACHI。

甲醇、乙腈HPLC 纯（德国Merck），水为超纯水，乙酸锌、亚铁氰化钾、乙酸铅、乙酸铵、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、草酸钾和钨酸钠均为分析纯。标准品：山梨酸、苯甲酸、糖精钠（国家标准物质中心），对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、安赛蜜、脱氢醋酸纯度均＞99.0%，购自Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 前处理方法

称取5.0 g 经均质处理的样品于50 mL 比色管中，向比色管中加入30 mL 甲醇-磷酸盐缓冲溶液（1+1）、1 mL 1%三氯乙酸振荡超声30 min，漩涡振荡5 min，然后用甲醇-磷酸盐缓冲溶液（1+1）定容至刻度，5 000 r/min 离心5 min。取上清液过0.2 μm 有机相滤膜，供HPLC 仪器分析。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：phenomenex Gemini C18（250×4.6 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；流动相：甲醇和0.02 mol/L 乙酸铵，梯度洗脱程序：0～5 min，10%～35%甲醇；5 min ～15 min，35%～74%甲醇；15 min ～20 min，74 %～90 %甲醇；20 min ～25 min，90 %～10 %甲醇。Agilent DAD 检测器，检测波长：230 nm 和254 nm；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 提取液的选择

本研究比较了甲醇水（1 ∶1）溶液、甲醇磷酸盐缓冲溶液（pH=6.8）（1 ∶1）、乙腈水（1 ∶1）和乙腈磷酸盐缓冲溶液（pH=6.8）（1 ∶1）4 种提取液对9 种组分同时提取的提取效果，结果表明4 种提取液的提取效果均可达到检测需要。其中乙腈水和乙腈磷酸盐缓冲溶液净化效果优于甲醇水溶液和甲醇磷酸盐缓冲溶液，但是乙腈水和乙腈磷酸盐缓冲溶液提取会导致安赛蜜和糖精钠出现前展峰，通过调节流动相比例及pH 峰型仍无明显改善，且乙腈较甲醇毒性大、成本高，因此综合考虑后不选择含乙腈的提取液。同时发现甲醇磷酸盐缓冲溶液回收率高于甲醇水溶液，且相对净化负担小，因此本研究采用甲醇磷酸盐缓冲溶液（pH=6.8）（1 ∶1）作为提取液。四种提取液提取效率图见图1。

图1 4 种提取液提取效率比较Fig.1 The comparison of extraction efficiency with different extraction solvents

2.2 沉淀剂的选择

由于猪肉中及其熏煮香肠基质复杂，含有较多的蛋白质、脂肪等，因此需要选择合适的沉淀剂进行进一步的净化。食品添加剂检测常用的沉淀剂有亚铁氰化钾-乙酸锌；硫酸-钨酸钠；乙酸铅、草酸钾-磷酸氢二钾等沉淀体系及三氯乙酸、冰醋酸等溶液，其中亚铁氰化钾-乙酸锌沉淀体系通过络合效应使蛋白质等物质沉淀，而后几种沉淀剂均是通过使蛋白质变性达到净化效果。本研究通过比较几种沉淀剂在猪肉中及其熏煮香肠基质的净化效果，发现亚铁氰化钾-乙酸锌沉淀体系和三氯乙酸的净化效果较其它几种好，但是亚铁氰化钾-乙酸锌沉淀体系由于沉淀能力过强，会使山梨酸和苯甲酸回收率降低约10%，而1%三氯乙酸沉淀效果好且回收稳定，因此本研究采用1%三氯乙酸作为沉淀剂。

2.3 检测波长的确定

安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸酯类化合物因其结构不同，在紫外区的特定吸收波长也不同，本研究用标准溶液在190 nm～800 nm波长下进行3D 光谱扫描，发现各自的最大吸收波长分别为安赛蜜226 nm、苯甲酸224 nm、山梨酸254 nm、糖精钠202 nm、脱氢乙酸230 nm、对羟基苯甲酸酯类化合物254 nm，与已有文献报道一致[1-12]。其中安赛蜜、苯甲酸、脱氢乙酸在230 nm 处有较高的灵敏度，而对羟基苯甲酸酯类化合物、山梨酸在254 nm 处紫外吸收较高，在230 nm 处吸收偏低，综合考虑9 种物质的灵敏度，本研究最终选择在230 nm 和254 nm 两种波长下同时检测9 种添加剂，标准品液相色谱图见图2。

图2 标准品液相色谱Fig.2 Chromatogram of standard solution

2.4 线性范围、标准曲线方程及定量限

在实验条件下，以峰面积Y 为纵坐标，质量浓度X（mg/L）为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程，以基线噪声10 倍峰面积对应的各组分质量浓度为定量限（S/N=10），7 种防腐剂和2 种甜味剂标准曲线方程、线性范围和定量限见表1。

表1 9 种目标物的标准曲线方程、线性范围、相关系数和定量限Table 1 Standard curve equations，linear ranges，correlation coefficients and limits of quantification of 9 target analytes

2.5 方法回收率及精密度

在不同的熏煮香肠和猪肉样品中添加文中所测防腐剂和甜味剂，分别添加3 个不同浓度水平的混合标准溶液，每个水平重复测定6 次，采用外标法进行定量，计算回收率和精密度。试验结果表明本方法9 种防腐剂和甜味剂的回收范围85.25%～98.26%，RSD 值为1.26%～5.39%（详见表2），表明本方法有良好的精密度和准确度，满足分析要求。

表2 样品中9 种目标物的回收率及相对标准偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 9 target analytes spiked in the sample（n=6）

续表2 样品中9 种目标物的回收率及相对标准偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 9 target analytes spiked in the sample（n=6）

图3 检出山梨酸的火腿肠色谱图Fig.3 Chromatogram of ham containing sorbic acid

2.6 实际样品测定

采用本方法对市售7 种熏煮香肠和3 种猪肉进行检测，所测7 种熏煮香肠中均检出山梨酸，其中一种火腿肠所测山梨酸含量为70 mg/kg（色谱图见图3），猪肉中均未检出文中所测防腐剂和甜味剂。国家规定肉类制品中山梨酸的限量为0.075 g/kg，熏煮香肠中山梨酸的限量为1.5 g/kg，因此所测熏煮香肠符合国家标准要求。

3 结论

本研究建立了测定猪肉及熏煮香肠中7 种防腐剂和2 种甜味剂的高效液相色谱法，样品经甲醇-磷酸盐缓冲溶液（1+1）、1 mL 1%三氯乙酸振荡超声、漩涡振荡提取，phenomenex Gemini C18 色谱柱分离后于230 和254 nm 下定性、定量分析，外标法定量。该方法灵敏度高、操作简单高效，适用于猪肉及熏煮香肠中7种防腐剂和2 种甜味剂定性、定量分析。

[1] 中华人民共和国卫生部, 中国国家标准化管理委员会.GB2760食品添加剂使用卫生标准[S].北京:中国标准出版社,2007

[2] 汪莉,王臻,赖少阳,等.粉、面制品中添加剂使用调查分析[J].实用预防医学,2005,12(5):1164-1165

[3] Routledge E J, Parker J, Odum J, et al. Some alkylhydroxybenzoate preservatives(parabens)are estrogenic[J]．Toxicol Appl Pharm,1998,153(1):12-19

[4] 刘利敏, 彭敬东．5 种甜味添加剂的反相高效液相色谱法同时测定[J]．分析测试学报,2008,27(5):549-552

[5] 汪辉,曹小彦,陈利国,等．高效液相色谱法同时测定蜜饯中五种常见食品添加剂[J]．分析试验室,2007,26(11):119-121

[6] B Saad, MF Bari, MI Saleh, et al． Simultaneous determination of preservatives (benzoic acid,sorbic acid,methylt,araben and propylparaben)in foodstuffs using hish-performance liquid chromatography[J]．J Chromatogr:A,2005,1073(1/2):393-397

[7] 陈皑,何乔桑,王萍亚,等．固相萃取一高效液相色谱法测定水果和果酱中的6 种对羟基苯甲酸酯[J]．色谱,2009,27(6):804-808

[8] 李帮锐,冯家力,潘振球,等．高效液相色谱一质谱/质谱联用法测定饮料中的人工合成色素[J]．中国卫生检验杂志,2007,17(4):579-585

[9] 崔小军．关于运用HPLC 同时测定饮料中安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸以及合成色素的研究[J]．食品研究与开发,2004,25(3):117-118

[10] 王晓强,胡文炬,张摹．高效液相色谱法测定化妆品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂[J]．色谱,1994,12(2):144-145

[11] M Gonzalez,M Gallego,M Valcarcel．Simultaneous gas chromatographic determination of food preservatives following solid-phase extraction[J]．J Chromatogr:A,1998,823(1/2):321-329

[12] 沈吴宇,应丽艳,曹云峰,等．固相萃取一气相色谱/质谱法同时测定化妆品中的邻苯二甲酸酯和对羟基苯甲酸酯[J]．色谱,2007,25(2):272-275

[13] 中华人民共和国卫生部, 中国国家标准化管理委员会． GB/T 5009．31—2003 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定方法[S]．北京:中国标准出版社,2003

[14] 漆爱明,李玫瑰,毛丽秋．微滴液相微萃取技术用于气相色谱一质谱法分析药品中的酞酸酯和对羟基苯甲酸酯[J]．色谱,2008,26(3):306-309

[15] 罗志刚,唐昊天,孙伯文,等.高效液相色谱法同时测定饮料中合成色素、甜味剂和防腐剂[J].2010,17(8):1156-1158