响应曲面法优化灰枣多糖的提取工艺

彭雪萍，李星科，马路遥，王会晓，纵伟

（郑州轻工业学院食品与生物工程系，河南郑州450002）

大枣营养丰富，不但含有大量的糖类物质，还含有VC、核黄素、硫胺素、胡萝卜素、尼克酸等多种营养成分，可谓“补品之王”[1-3]，此外大枣还具有广泛的药用价值，可提高人体免疫功能，增强抗病能力。研究表明，大枣多糖是大枣的主要活性成分之一，具有免疫、兴奋、清除自由基、抗衰老作用，目前，国内外对大枣多糖的提取已有一些文献报道[4-6]，而灰枣是河南省主要的大枣品种，而对灰枣多糖的研究较为少见。因此，本文利用水提法，通过单因素及响应曲面法优化实验[7-8]，研究各因素对多糖得率的影响，为灰枣多糖的开发利用提供一定技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

灰枣：采自河南新枣，45 ℃烘干，粉碎到40 目后备用。

1.1.2 仪器

RE-52A 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SP-2102PC 分光光度计：上海光谱仪器有限公司；LXJ-64-01 离心机：北京医疗器械总厂。

1.2 试验方法

1.2.1 提取方法

称取干燥、去核、粉碎的灰枣50 g 放入具塞圆底烧瓶，加入适量水并混匀，按各种设定条件（温度、料液比、时间）进行提取，过滤后离心，滤渣加入一定量的水进行第2 次提取，合并2 次提取液，浓缩，将糖提取液加80%乙醇沉淀，静置5 h，离心，氯仿正丁醇脱蛋白，然后复溶，测定多糖含量。

1.2.2 测定方法

多糖含量测定：苯酚硫酸法[9-10]

得率（%）=提取物中多糖的含量/灰枣干物质质量×100%

1.2.3 单因素对多糖提取效果的影响

1.2.3.1 提取次数对多糖提取效果的影响

料液比1 ∶20，提取温度80 ℃，分别提取1、2、3次，每次提取4 h，研究提取次数对多糖得率的影响。

1.2.3.2 不同料液比对多糖提取效果的影响

料液比（g/v）分别为1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30，提取温度80 ℃、提取2 次，每次提取4 h，研究不同料液比对多糖得率的影响。

1.2.3.3 不同温度对多糖提取效果的影响

料液比1 ∶20，于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃分别提取4 h，各提取2 次，研究提取温度对多糖得率的影响。

1.2.3.4 不同提取时间对多糖提取效果的影响

料液比1 ∶20，提取温度80 ℃，每次提取时间分别为：1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，提取2 次，研究提取时间对多糖得率的影响。

1.2.4 响应曲面法优化试验

在上述单因素试验的基础上，采用中心组合试验Box-Behnden 设计方案，以A、B、C 代表料液比、提取温度、提取时间三因素，并以-1、0、+1 分别代表自变量的低水平、中水平、高水平，试验设计因素水平如表1。

表1 Box-Behnden 试验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of test design of Box-Behnden

2 结果与分析

2.1 单因素试验及分析

2.2.1 提取次数对灰枣多糖提取效果的影响

提取次数对多糖提取效果的影响见表2。

表2 提取次数对灰枣多糖得率的影响Table 2 Effect of extract number of times on yield rate of Gray Jujube polysaccharide

由表2 可知，提取一次，可提取多糖的61.55 %，提取两次，可达到87.69%，随着提取次数的增加，提取效率显著下降，且次数越多，后序的浓缩负荷越重，而且还会影响生产周期，因此考虑到试际生产成本，采用二次浸提较为适宜。

2.2.2 料液比对灰枣多糖提取效果的影响

料液比对灰枣多糖提取效果的影响结果如图1。

图1 料液比对灰枣多糖得率的影响Fig.1 Effect of material-to-liquid on yield rate of Gray Jujube polysaccharide

由图1 可知，随着料液比例的增大，多糖溶出率逐渐增加，1 ∶20 时达到最高。但若进一步提高比例，多糖得率反而下降，可能是比例太大，杂质溶出较多，有效成分并未增加，这样既费料又费工，所以综合考虑应选择1 ∶20。

2.2.3 温度对大枣多糖提取效果的影响

温度对大枣多糖提取效果的影响结果如图2。

图2 温度对灰枣多糖得率的影响Fig.2 Effect of temperature on yield rate of Gray Jujube polysaccharide

由图2 可以看出，随着温度的升高，多糖得率增加，在80 ℃时最高。这是由于温度升高，分子运动加剧，多糖从大枣细胞中的溶出率增加。但如温度继续升高，则得率反而下降，可能是温度太高，会破坏一些有效成分。

2.2.4 时间对大枣多糖提取效果的影响

时间对大枣多糖提取效果的影响结果如图3。

由图3 可知，随着时间的延长，多糖得率逐步增加，当时间由2 h 增加至4 h 时，得率由1.64%增加到2.04%，但随着时间的延长，得率不再上升，可能是大枣细胞液中和提取液中的多糖达到了平衡。时间再延长得率反而下降，也许是多糖结构发生了变化，故提取时间4 h 最佳。

2.3 响应曲面法试验结果及分析

2.3.1 提取时间、料液比和提取温度三因素优化试验

单因素试验结果表明，多糖提取时间4 h，料液比1 ∶20，80 ℃条件下提取效果最好，根据各提取条件，做出响应面试验设计及结果如表3。

表3 灰枣多糖得率（料液比、温度、时间）试验方案与结果表Table 3 Test plan and results of yield rate（material-to-liquid，temperature、time）of Gray Jujube polysaccharide

2.3.2 模型的建立及显著性检验

利用Design-Expert 软件对表3 试验数据进行多元回归拟合，可得到料液比（A）、温度（B）和时间（C）三因素的二次多项回归模型为：

回归模型系数显著性检验结果见表4。

表4 灰枣多糖得率回归模型系数的显著性检验结果Table 4 Inspect result of conspicuousness of regression model coefficient of yield rate of Gray Jujube polysaccharide

由表4 回归模型系数显著性检验结果可以看出，该模型回归显著（p=0.0004＜0.05），模型的一次项A，C显著，B 不显著；二次项A2，B2显著，C2不显著；交互项AB、BC 显著，AC 不显著。此模型拟合度好，可以用来分析和预测灰枣多糖的提取工艺及结果。

2.3.3 水提法提取大枣多糖的响应面分析与优化

根据试验方案与结果（表3）作出相应曲面图4～图6。

图4 料液比、温度对多糖得率的响应曲面图Fig.4 Response surface figure of material-to-liquid，temperature on yield rate of polysaccharide

图5 料液比、时间对多糖得率的响应曲面图Fig.5 Response surface figure of material-to-liquid，time on yield rate of polysaccharide

图6 温度、时间对多糖得率的响应曲面图Fig.6 Response surface figure of temperature，time on yield rate of polysaccharide

由图4～图6 可以看出，温度和料液比、温度和时间之间的交互作用显著，相比较而言，时间和固液比之间的交互作用较小；从图4 可以看出，料液比、温度对多糖得率的影响最大，随着固液比和温度的增加，多糖得率也随之增加。优化后的提取条件为：料液比1 ∶20，时间为4 h，温度为80 ℃，在此条件下多糖的得率可达到2.8%。

3 结论

经过单因素试验证明了提取次数对多糖得率有一定影响，以2 次提取最佳；不同料液比试验结果为1 ∶20 时得率最高，1 ∶25 次之；不同提取温度试验证明80 ℃时提取效果最好，90 ℃次之；不同提取时间的试验结果为：4 h 时多糖的提取效果最好，5 h 略有降低。经过响应曲面法建立二次多项回归方程的预测模型，优化灰枣多糖的提取工艺，得出最佳工艺参数为：料液比1 ∶20，提取温度80 ℃，提取时间4 h，得率为2.8 %。结果证明，该优化工艺稳定，试验结果与模型预测值相符，可预测和分析多糖的提取工艺及结果，为灰枣资源的开发和利用奠定基础。

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