越橘花色苷稳定性研究

张志博 ，李安文，李勤 ，肖文军，3，*

（1.湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙410128；2.湖南农业大学园艺园林学院植物资源工程系，湖南长沙410128；3.湖南农业大学园艺园林学院茶学系，湖南长沙410128）

越橘，果实为蓝色或红色浆果，杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）多年生落叶或常绿灌木[1]。越橘花色苷作为天然植物色素，具有良好的生物活性以及抗氧化、抗炎抗癌、降血脂、保护视力的生理功能[2-9]，在临床药用以及保健食品开发方面均具有广泛的应用前景[10]。但是，由于越橘花色苷特殊的C6-C3-C6碳骨架特征结构使其稳定性较差[11]，限制了越橘花色苷在加工和贮藏过程中的应用范围。目前对于越橘花色苷的研究多集中于提取检测、分离纯化及药理作用等方面[12-13]，而对其稳定性缺少系统的研究[14-18]。本文以越橘浓缩汁为原料，通过单因素试验和正交试验系统考察了不同pH 条件、温度、时间、离子种类和氧化剂等因子对越橘花色苷稳定性的影响，以期为越橘花色苷加工和贮藏提供一定的科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 试验原料

越橘浓缩果汁：黑龙江尚志绿野浆果有限公司，百粒糖度（65±2）°，花色苷含量3.25 mg/g。

1.1.2 仪器与试剂

Lab Tech 可见-紫外分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；EASY pureⅡ纯水仪、SK3300LH 超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；HH 数显恒温水浴锅：金坛市金城国胜实验仪器厂；RE-52AA 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；pH 计、FA2104S 电子分析天平：上海精科天平厂；SHB-Ⅲ型循环水真空泵：巩义市英峪仪器厂；氯化钠、二氯化锡、氯化铜、氯化铁、氯化钾、浓盐酸、乙酸钠、乙酸、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：国药集团；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品：上海永恒生物科技有限公司，纯度98.5%。

1.2 方法

1.2.1 越橘花色苷含量检测

取越橘浓缩果汁稀释到一定浓度，全波长扫描，确定最大吸收波长。采用pH 示差法[19]以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品为标样对越橘花色苷的吸光度值进行检测，根据其吸光度值代入标准曲线算得其含量。

1.2.2 加标回收率实验

取越橘浓缩果汁稀释加入相同量的标准品，在520 nm 和700 nm 下检测吸光度值，计算越橘花色苷含量。

1.2.3 pH 对越橘花色苷稳定性的影响

用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液将越橘浓缩汁配制成pH 分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的溶液，室温放置3 h，取样检测其吸光度，计算越橘花色苷含量。

1.2.4 温度对越橘花色苷稳定性的影响

将越橘花色苷浓缩汁稀释到相同浓度，分别于4、25、40 ℃条件下放置4.0 h，测定其吸光度，计算越橘花色苷含量。

1.2.5 时间对越橘花色苷稳定性的影响

将越橘花色苷浓缩汁稀释到相同浓度，室温下放置7 h，每隔1 h 取样测定其吸光度，计算越橘花色苷含量。

1.2.6 不同离子对越橘花色苷稳定性的影响

将越橘花色苷浓缩汁稀释到相同浓度，分别加入KCl、FeCl3、CuCl2、FeCl2、SnCl2溶液，室温下放置1 h 测定其吸光度，计算越橘花色苷含量。

1.2.7 不同氧化剂对越橘花色苷稳定性的影响

将越橘花色苷浓缩汁稀释到相同浓度，分别加入H2O2、FeCl3、CuCl2溶液，室温放置2.0 h，每隔0.5 h 取样测定其吸光度，计算越橘花色苷含量。

1.2.8 正交试验

根据单因素试验的结果，选取pH、温度、时间3个对越橘花色苷稳定性影响较大的因素，以花色苷的含量为指标，进行L9（33）正交试验，考察越橘花色苷的稳定性，正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表L9（33）Table1 Factors and levels in the orthogonal array experimental design

2 结果与分析

2.1 越橘花色苷检测波长的确定

2.1.1 最大吸收波长的确定

由图1 可知越橘花色苷在波长为440 nm～680 nm之间有一最大吸收峰（图上的1 所标注位置）值为520 nm。因此选取λ=520 nm 作为检测波长进行检测。

图1 越橘花色苷的全波长吸收图谱Fig.1 The absorb curve of the anthocyanin of lingonberry at a whole wavelength

2.1.2 加标回收率实验结果

选择3 个不同梯度的标准物质浓度，得最终的回收率分别为96.0 %，98.1 %和101.3 %，说明在pH=1.0，λ=520 nm 波长条件下0.295～0.870 7 吸光度值在范围内，对越橘花色苷含量测定准确有效。

2.2 越橘花色苷稳定性的研究

2.2.1 pH 对越橘花色苷稳定性的影响

pH 对越橘花色苷稳定性的影响见图2。

图2 pH 对越橘花色苷稳定性的影响Fig.2 Effect of the different pH conditions on the stability of lingonberry anthocyanins

由图2 可知，在pH1.0～pH3.0 之间时，越橘花色苷的含量相对稳定，且在pH=3.0 时含量最高，达0.257 mg。随着pH 的逐渐加大，越橘花色苷含量逐渐降低，说明越橘花色苷在pH=3.0 时稳定性较高。

2.2.2 温度对越橘花色苷稳定性的影响

温度对越橘花色苷稳定性的影响见图3。

图3 温度对越橘花色苷稳定性的影响Fig.3 Effect of different temperatures on the stability of lingonberry anthocyanins

由图3 可知，越橘花色苷的含量随温度的增加呈明显的下降趋势，说明温度越低越橘花色苷稳定性越好。

2.2.3 时间对越橘花色苷稳定性的影响

时间对越橘花色苷稳定性的影响见图4。

图4 时间对越橘花色苷稳定性的影响Fig.4 Effect of different storing time on the stability of lingonberry anthocyanins

由图4 可知，随着放置时间的增加，越橘花色苷的含量总体呈下降趋势，放置时间越长其稳定性就越差；可能是由于其结构发生变化的缘故，也可能是在放置过程中受到光照等其他因素的影响而使含量发生变化。

2.2.4 不同离子对越橘花色苷稳定性的影响

不同离子对越橘花色苷稳定性的影响见图5。

图5 不同离子对花色苷稳定性的影响Fig.5 Effect of different ions on the stability of lingonberry anthocyanins

从图5 可以看出，不同金属离子对越橘花色苷的稳定性均有不同程度的影响。其中K+、Fe2+、Sn2+对越橘花色苷有一定的保护作用，而Fe3+、Cu2+对花色苷的稳定性影响较大，花色苷损失较多，可能是越橘花色苷中的酚羟基结构与Fe3+、Cu2+发生反应生成沉淀，使其稳定性降低。

2.2.5 不同氧化剂对越橘花色苷稳定性的影响

不同氧化剂对越橘花色苷稳定性的影响见表2。

表2 不同氧化剂对越橘花色苷稳定性的影响Table 2 Effect of the different oxidants on the stability of lingonberry anthocyanins

从表2 可知，不同氧化剂对越橘花色苷稳定性都有不同程度的影响，而H2O2和FeCl3在同一浓度下比CuCl2对越橘花色苷的影响要明显，而且各种氧化剂对越橘花色苷的破坏程度与浓度存在一定的关系，浓度越高，花色苷受破坏的程度越大，其的稳定性就越低；在不同的时间段内，氧化剂对越橘花色苷稳定性的影响也不同，前期H2O2作用更为明显，后期FeCl3、CuCl2较为明显。氧化剂H2O2前期对花色苷的稳定性影响更为明显，可能是由于过氧化氢容易分解，随着时间延长其分解程度加大，氧化性降低的缘故。

2.2.6 正交试验

L9（33）正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 L9（33）正交试验结果Table 3 Results of the optimizing examination

表4 方差分析结果Table 4 Results of the analysis of variance

从表3 可看出，在pH1.0～pH3.0 的范围内，温度、pH、时间三因素对花色苷稳定性的影响大小依次为：温度＞pH＞时间。由表4 可知，在处理3 中越橘花色苷降解量最大，即在pH=1.0 温度40 ℃时间5 h 条件下花色苷稳定性最低；处理7 中花色苷的降解量最少，即当温度4 ℃、pH=3.0、时间5 h 时花色苷稳定性最强。

3 结论

本文通过单因素试验和正交试验对越橘花色苷的稳定性的影响因素进行了研究，发现不同的试验条件处理对花色苷的稳定性影响程度不同，在温度4 ℃、pH=3.0、时间5 h 时花色苷稳定性最好，这可能是花色苷贮藏的最佳条件。但由于实验条件的限制，本研究并未涉及糖苷酶，多酚氧化酶等酶类以及辅色剂、糖及降解产物等对越橘花色苷稳定性的影响。随着基因工程技术和细胞生物学研究的不断深入，通过化学修饰等技术手段改变越橘花色苷的结构或通过生物工程技术方法生产高稳定性的细胞等方法来提高越橘花色苷的稳定性可能是未来发展的一个方向。

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