单核细胞增生性李斯特菌生物被膜形成调控机制研究进展

张 辉，崔焕忠，郑 鑫

（吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春130118）

单核细胞增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是重要的人兽共患食源性病原菌，可引起人、多种动物感染发病，病死率高达20%～30%。近年来，李斯特菌病在世界范围内都有发生，并且发病具有上升趋势。由于该菌在自然界中广泛存在，并可形成生物被膜，增强了该菌对外界环境的抵抗力。李斯特菌病的发生80%是由生物被膜引起，由于生物被膜的多重耐药性，给临床治疗带来巨大困难［1］，严重的危害了人们健康，影响畜牧业发展。深入了解生物被膜形成调控机制，将有助于寻找生物被膜形成的抑制剂，降低人和动物感染发病的几率［2］。

生物被膜（biofilm，简称BF）的概念最初是由加拿大微生物学家J.William Costerton提出来的，是指细菌粘附于接触表面，分泌胞外多聚物，将自身包绕而形成的微生物群落。细菌生物被膜形成及成熟过程涉及复杂的细胞间信号转导机制，目前证实有3种信号分子参与机制的调节。革兰阴性菌具有酰基高丝氨酸内酯自身诱导剂，革兰阳性菌和革兰阴性菌均具有自身诱导剂2（Autoinducer－2，AI－2），AI－2是惟一一个在革兰阳性菌与阴性菌中同时存在的群感效应系统，而革兰阳性菌则利用缩氨酸介导的信号通路进行信号调节［3］。

1 正向调控机制

1.1 转录调节子PrfA对生物被膜形成的调控PrfA是正向调控生物被膜形成的因子之一。研究发现与野生型菌株EGD相比，PrfA基因突变菌株（ΔPrfA）形成生物被膜的能力明显降低，倒置显微镜下观察到EGD株能形成致密的链网状膜结构，交联度较高，而ΔPrfA株形成的链网状膜结构相对比较疏松，交联度稍低。统计分析表明，EGD株与无害李斯特菌之间形成生物被膜的差异显著。而无害李斯特菌几乎没有成型的链网状膜结构形成，暗示生物被膜的形成可能与LM的致病性有关［4］。

PrfA蛋白是转录调节子CRP－FNR家族的成员之一，小分子辅助因子调控许多家族成员蛋白的活性状态［5］。利用点突变构建两个基因突变菌株，研究其对生物被膜形成的影响。在基因突变菌株prfA＊中，变异PrfA蛋白的功能被限定在细胞内活力状态，即在宿主细胞浆内能够持续表达毒力因子ActA蛋白，并可通过激活PplcA，增加PrfA蛋白的表达；而在基因突变菌株PrfA（Y154C）中，变异的PrfA蛋白不能完全转变为胞内活力状态，即在胞内感染阶段不能正向调控ActA蛋白表达，虽然可以进入宿主细胞浆但是不能完成细胞间的扩散。prfA＊在室温和30℃下形成的生物被膜量与野生型相同，但是在36℃下比野生型要少。PrfA（Y154C）在30℃和36℃下形成生物被膜的量均增加，但是在室温下与野生型菌相同。不能完全转变为胞内活力状态的突变菌株有利于生物被膜的形成，生物被膜形成能力的增加可能是由于PrfA蛋白变构调节的结果［4］。

1.2 DegU LM具有17个编码二组分系统的基因簇，枯草杆菌DegS/DegU系统在控制细菌静止期适应性反应方面起着重要作用［6］。研究表明LM不存在DegS激酶的同源基因，但具有DegU（降解酶调节因子）反应调节同系物，DegU作为孤立的反应调节器，在调控细菌一些重要的适应性反应方面发挥着重要的作用［7］。灭活DegU基因表明，DegU通过直接与DegU基因启动子区结合，从而负调控自身合成。DegU基因与其下游的yviA基因共转录。DegU为LM鞭毛合成及细菌运动性所必需，也是细菌在高温条件下生长，粘附到塑料表面并有效形成生物被膜所需要的因子［8］。

1.3 Agr操纵子 Agr操纵子可以调控毒力因子的表达，并与生物被膜的形成相关。Agr操纵子为LM的群感效应系统，正向调控生物被膜的形成［9］。Agr操纵子包括agrB、agrD、agrC和agrA四个因子，Aurélie等分别构建了agrA和agrD框内缺失菌株，研究了Agr操纵子对生物被膜形成的影响，结果表明，基因缺失菌株ΔagrA和ΔagrD对玻璃片的粘附能力均显著降低，表明Agr操纵子参与生物被膜形成的粘附过程。在生物被膜形成的早期，突变体ΔagrA和ΔagrD在聚苯乙烯上形成生物被膜的能力明显低于亲本菌株［10］。agrA和agrD双基因缺失菌株对静止或动态培养LM生物被膜的形成都有影响。Agr操纵子可以直接调控生物被膜形成，还可通过调控LM毒力因子的表达间接调生物被膜形成［11］。

1.4 其他正向调控因子 压力调控因子sigma B与LM生物被膜的形成有关，张强等比较了EGD、基因缺失菌株Δsigma B以及无害李斯特菌生物被膜的形成能力，结果表明3种菌株形成生物被膜的能力具有一定的差异，暗示sigma B对生物被膜的形成具有一定的影响［12］。

LM的胞外DNA是细菌最初粘附和生物被膜形成的必要物质，胞外DNA通过某种特定的方式与肽聚糖的N－乙酰葡萄糖氨相互作用，参与生物被膜形成的粘附过程，这种粘附过程需要高分子质量的DNA参与，而且细菌表面的粘附位点可以被DNA 饱和［13］。

LM需要借助鞭毛的趋化运动使浮游的细菌向有营养物质的表面游动，并克服表面张力到达并粘附到物体表面，使粘附的细菌个体从载体表面播散出去，与细菌的胞外基质相互作用，在生物被膜中起桥梁作用，形成稳定生物被膜结构［14－15］。

2 负向分子调控机制

2.1 ABC转输通透酶对生物被膜形成的调控Zhu等采用转座子诱变构建基因缺失菌株，该基因缺失菌株Δ1771形成生物被膜能力增强，lm.G_1771基因可能编码ABC转运通透酶，表明ABC转输通透酶负调控生物被膜的形成［16］。转录组学研究表明，lm.G_1771基因通过调节编码Dlt表面蛋白、细胞表面锚定蛋白SrtA以及转录调节子GntR等参与生物被膜形成的候选基因来调控生物被膜的形成。基因缺失菌株Δ1771对曲拉通－100敏感性和阳离子抗生素增加。dlt基因参与将丙氨酸残基合并为脂磷壁酸过程，由于基因缺失菌株Δ1771中Dlt操纵子基因的下调，导致磷壁酸表面带正电荷，使突变菌株对阳离子抗生素的抵抗力降低［17］。通过同源重组获得的回复体形成生物被膜的量与野生型菌株相同。

2.2 luxS对生物被膜形成的调控luxS基因编码S－核糖基高半胱氨酸酶，该酶可将S－核糖基高半胱氨酸（S－ribosyl homocysteine，SRH）催化水解为高半胱氨酸和4，5－二羟基－2，3－戊二酮（DPD），DPD经过化学修饰形成自身诱导物－2（AI－2），AI－2是细菌种间信息传递的因子。luxS参与多种致病菌生物被膜的形成［18］。研究发现，luxS基因缺失菌株的粘附能力比亲本菌株高19倍，并且形成生物被膜的量也相应增加。但是外源的AI－2不能使突变菌株恢复野生型表型，推断luxS基因可能通过三维复合构造参与抑制细胞粘附及生物被膜的形成过程，这一调控机制与可能 AI－2无关。Challan等［19］通过比较luxS基因缺失菌株与EDG株之间的浮游生长、浮游运动性、磷脂酶活性、溶血活性以及生物被膜形成的差异，研究luxS对生物被膜形成的调控，结果发现，连续培养48h，luxS基因缺失菌株形成生物被膜的密度比野生型菌株EDG高17倍，并且在细菌培养上清液中S－腺苷高半胱氨酸（S－adenosyl homocysteine，SAH）和SRH的含量均高于亲本菌株，并证实了生物被膜的形成与AI－2和SAH无关，而是通过SRH调节粘附细胞的数量，调控生物被膜的形成，但是其确切调控机制尚不清楚。

3 理化因素对生物被膜形成的影响

生物被膜的形成受营养条件、温度、生长环境及粘附材料种类等因素的影响［20］。Begley等［21］发现，在胆汁的存在下，细菌通过调整多种代谢途径来加快其生长速度，增强生物被膜的形成能力。刘彤等［22］研究了温度对生物被膜形成的影响，结果表明，随着培养温度下降生物被膜形成显著减少。添加适量的葡萄糖可以提高形成生物被膜的能力，表明富含营养的环境有利于LM形成生物被膜［23］。低浓度的NaCl（低于0.5%）可促进生物被膜的形成，高浓度NaCl则会抑制生物被膜的形成。

4 问题与展望

生物被膜的形成受调控因子的调控，目前对LM生物被膜形成相关调控因子的研究，主要是发现未知的与生物被膜形成相关的基因以及验证一些已知功能基因在其生物被膜形成中的作用［24］。而有关调控生物被膜形成的确切分子机制以及生物被膜分子间信号的转导等方面的研究还不是非常深入，因此今后研究方向应集中于生物膜形成分子调节机制、相关基因之间的表达调控，以及一些控制技术领域。详细了解生物被膜形成的机制，对于寻找生物被膜形成抑制剂，以及有效地控制生物被膜的形成具有重要意义。

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