空肠弯曲菌感染动物模型的研究进展

商宇伟，王楠，黄金林，焦新安

(扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏 扬州 225009)

20 世纪70年代，空肠弯曲菌(Campylobactor jejuni)首次被分离和鉴定后，空肠弯曲菌及其相关诱发性疾病已成为近四十年来的研究热点。目前，空肠弯曲菌性感染被认为是全世界最主要的食物和水源性疾病之一［1］。空肠弯曲菌主要导致人和动物的细菌性胃肠炎(bacterial gastroenteritis)和急性腹泻。免疫力低下者感染后会产生心内膜炎、关节炎、骨髓炎、脑炎、败血症等全身性疾病，特定血清型的空肠弯曲菌感染可引起周围神经自身免疫性格林－巴利综合征(GBS)。GBS 是一种急性的脱髓鞘多发性自身免疫疾病，以神经根、外周神经损害为主，主要表现为进行性肢体瘫痪，脑脊液蛋白升高［2］。

动物模型是研究空肠弯曲菌的致病机理、与宿主间的相互作用及研发疫苗的基础，研究者尝试了多种动物的空肠弯曲菌感染试验，主要包括灵长类动物、雪貂、猪、兔、啮齿类动物和鸡，综合考虑其疾病相似性、重复性及经济性，仍没有建立起良好的空肠弯曲菌感染实验动物模型，给致病机制、保护性抗原研究以及疫苗效力检验等造成困难。本文就近年来人们对空肠弯曲菌的动物模型研究取得的进展进行综述。

1 灵长类动物

在所有动物模型中，灵长类动物最接近人类，复制的疾病模型相似性好，但是资源匮乏，价格昂贵，饲养条件和设备复杂等缺点使之很难广泛应用。

1.1 猕猴(Macaca mulatta)

猕猴是空肠弯曲菌感染灵长类动物最常用的动物模型，经口服感染空肠弯曲菌后可产生和人类非常相似的症状，表现为呕吐、腹泻、便血，并且大多数动物出现了菌血症［3］。Dilara 等［4］应用猕猴模型检测空肠弯曲菌灭活全菌疫苗的安全性和免疫原性，为该疫苗在投入临床试验前做出非常有意义的评价。缺点是实验室开放环境中饲养的普通级猕猴自然感染率高，试验表现出的临床症状和相关感染的病理过程存在局限性，比如实验重复性不佳，病理不明显等，因此SPF 级别猕猴种群的发展和应用十分重要［3，5-6］。

1.2 夜猴(Aotus trivirgatus)

室内饲养的新世界猴可以避免自然感染的缺陷。空肠弯曲菌灌胃感染夜猴可引起100%的实验猴肠道定植、17% ～83%的腹泻率、67.7% ～100%的IgG 和IgA 抗体分泌，是评价空肠弯曲菌候选疫苗良好的动物模型［7］。随着研究的深入及免疫前空肠弯曲菌感染问题的解决，夜猴模型不失为可准确评价疫苗免疫效果及安全性的有用动物模型。

2 雪貂(Mustela Pulourius Furo)

雪貂是空肠弯曲菌的易感宿主，3 ～6 周龄雪貂口服感染空肠弯曲菌可引起典型的弯曲菌性感染症状。Doig 等［8］研究发现在给雪貂口服接种空肠弯曲菌24 h 后，即排泄绿色粘液样便，并且频繁出现便潜血，偶有厌食、脱水和菌血症发生，腹泻是自限性的，这与特异性免疫保护有关，其机制还有待探索。Bacon 等［9］用雪貂模型对空肠弯曲菌标准株81 －176 和 NCTC11168进行毒力比较，认为NCTC11168 是弱毒的，原因是缺少81 －176 中pVir质粒携带的4 个毒力相关基因。雪貂是研究空肠弯曲菌性腹泻常用而有效的体内感染模型，但是在药物(阿片酊)的辅助下以及高剂量(1010～1011cfu)的感染引起的弯曲菌病症状和人类感染症状的关联性有待进一步探索。

3 仔猪(Piglet)

由于猪的胃肠道和人很相似，所以猪常被用来做肠道感染的模型。用空肠弯曲菌感染悉生仔猪，在临床和病理的观察中，损伤和病变部位大多集中在大肠，盲肠和结肠在大约10d 的腹泻期间均出现水肿和炎症［10，11］。徐飞等［12］使用致GBS 的空肠弯曲菌活菌感染诱导巴马小型猪表现周围神经病，可引起81.8%实验仔猪出现轻重不同程度的症状。新生仔猪缺少母源黏膜抗体，感染空肠弯曲菌可产生明显的，与人类相似的弯曲菌感染症状，因此仔猪被认为是弯曲菌感染的理想模型，不足的是猪模型相关的研究太少［13］。

4 兔(Rabbit)

4.1 兔肠袢模型

成年兔肠道发达，可以人工改造肠道形成一种特殊的肠道感染模型，即肠袢模型。该模型的特点是通过对小肠的结扎造成肠道的物理堵塞使细菌更加容易定植及侵袭，并且可以探索细菌长期的致病效果和宿主的保护性免疫应答。Caldwell 等［14］应用兔小肠活结结扎(RITARD)模型证实了空肠弯曲菌在肠道内停留4 h 即可引起实验兔粘液样带血的腹泻症状，评价了不同菌株包括突变株的毒力作用以及研究宿主的黏膜和全身性免疫应答规律。Everest等［15］通过建立兔回肠环路测试(RILT)模型探索由空肠弯曲菌诱发的肠液分泌量与宿主cAMP、前列腺素E2、白细胞三烯B4 产生水平的相互关联性。Annika 等［16］建立了兔软组织腔(RTC)模型，通过微阵列分析筛选并鉴定出了空肠弯曲菌在宿主体内外表达差异显著的499 个基因，这些基因控制着空肠弯曲菌在体内早期的定植、热休克反应、三羧酸循环以及鞭毛部件等相关蛋白的表达和修饰。兔肠袢模型的建立，为研究宿主体液分泌、炎症反应以及细菌如何突破上皮屏障等带来方便，缺点是需要相当熟练的外科技术和复杂悉心的术后护理，由于过量的人为感染，手术创伤等因素，该模型也不能完全的反映人类疾病。

4.2 兔GBS 模型

Field 等［17］用胎儿弯曲菌人工感染6日龄仔兔没有检测出相关腹泻症状，但细菌可在兔体内短暂的定植。目前对口服感染兔腹泻模型的研究很少。在GBS 动物模型中，刘怀军等［18］用Penner 4 型空肠弯曲菌菌体灭活粗抗原加完全弗氏佐剂并充分乳化后，经皮下或腹腔多点注射反复免疫新西兰白兔后，引起了中枢神经系统的病变，动物发病率为10%。Nortina 等［19］用兔模型首次证明了GBS 中急性运动性轴索性神经病(AMAN)的分子模拟机制。

5 啮齿类动物

5.1 近交系小鼠

纯合子小鼠作为实验动物具有遗传背景清楚、个体差异小、易饲养等优点，因此常作为研究空肠弯曲菌感染的动物模型。弯曲菌诱导小鼠疾病的产生与鼠品系、接种剂量、菌株类型等因素有关。

5.1.1 BALB/c 小鼠

BALB/c 小鼠经口服感染空肠弯曲菌后能引起可再现的，短暂的肠道感染菌定植现象，但是不发生弯曲菌感染的典型腹泻症状，肠道组织也无病理变化。也有研究者尝试了其他可增强细菌毒力作用的攻毒途径，比如通过滴鼻接种5 ×109cfu 空肠弯曲菌81 －176 可引起70%的BALB/c 鼠死亡，并且感染是全身性的，死亡率与接种剂量、菌株类型有关［20］。通过腹腔感染尽管可引起成年小鼠肝和脾的弥散性感染但也没有明显的疾病症状［21］。普通小鼠模型很难做到标准化，它缺少稳定的可再现性，很难有效进行弯曲菌的毒力评价。但是在研究宿主免疫应答反应方面具有优势，Nadia 等［22］用标准株81 －176 滴鼻免疫BALB/c 小鼠，用ELISA 法测定肺中炎症细胞因子的分泌水平，该研究揭示了细胞因子在不同组织炎症程度以及细菌侵袭消退时的分泌动力学。通过重组空肠弯曲菌主要外膜蛋白PROA 作为疫苗免疫BALB/c 小鼠，可引起强烈的免疫应答，能有效的帮助机体抵御异种血清型空肠弯曲菌的感染［23］。

5.1.2 C3H 小鼠和C57BL/6 小鼠

Cristopher 等［24］认为鼠肠道菌群的竞争排他性限制了空肠弯曲菌的定植，他们使用限制肠道菌群的C3H 小鼠口服感染空肠弯曲菌，该模型可以使空肠弯曲菌更加有效、更加持久、更高程度地定植在小鼠肠道，但该模型的大肠组织的炎症过于轻微并且缺乏可观察的临床症状。Ruth 等［25］试验探究空肠弯曲菌脂低聚糖(LOS)的唾液酸作用对C57BL/6小鼠骨髓细胞在体内外的影响，发现可产生唾液酸的细菌可以被BM-MΦ 有效吞噬，并且可以刺激BM-MΦ 产生更多的IL-10，IL-6 和IFN-β，该实验对理解GBS 的诱发机制具有重要意义。

5.2 免疫缺陷小鼠

Hodgson 等［26］对C.B-17 SCID Beige 小鼠灌胃接种新鲜临床分离的空肠弯曲菌可引起10%的腹泻率。Young 等［27］尝试用胎儿弯曲菌攻毒SCID 小鼠无法检测到腹泻。由于腹泻率低，重复性不好等缺点，免疫缺陷小鼠的研究鲜见报道。

5.3 基因敲除小鼠

随着定向基因敲除技术的日益成熟，相关基因敲除小鼠越来越多的用于空肠弯曲菌感染模型的建立。Mansfield 等［28］建立了空肠弯曲菌口服感染的C57BL/6 IL-10－/－小鼠模型，NCTC11168 可在IL-10－/－小鼠模型中长期定植，并可诱导可观察的腹泻症状，该模型在研究空肠弯曲菌致病机理上具有很大的潜力。Bell 等［29］应用IL-10－/－小鼠模型评价并分析了24 株空肠弯曲菌不同MLST 型分离株的致病性差异。Olivia 等［30］研究空肠弯曲菌腹腔感染NRAMP1－/－小鼠，表明小鼠对感染菌的抵抗作用是高度依赖NRAMP1 的，NRAMP1 能快速有效清除定植在宿主各脏器中的感染菌。Stefan 等［31］使用含特定肠道菌群的MYD88－/－、TRIF－/－、TLR4－/－、TLR9－/－小鼠进行空肠弯曲菌口服感染试验，认为人类肠道菌群更加有利于空肠弯曲菌的定植，TLR4和TLR9 在空肠弯曲菌诱导小鼠免疫应答中是必需的，并且证实空肠弯曲菌的甲酸代谢也和宿主的免疫应答有重要关联。

5.4 仓鼠(Cricetidae)和豚鼠(Cavia porcellus)

通过灌肠，或者在西咪替丁和碳酸氢钠的辅助下口服感染仓鼠，可引起仓鼠产生与人类相似的腹泻性肠胃炎［32］。Paul 等［33］证明了空肠弯曲菌中LuxS 是引起怀孕豚鼠流产的关键因子。仓鼠和豚鼠感染模型相关的研究太少无法很好的评价其重现性。

6 鸡

6.1 鸡疾病模型

鸡是空肠弯曲菌的天然宿主，1日龄的小鸡口服感染30 cfu 新鲜菌液，3d 后可在其盲肠内容物中检测到1 ×1010cfu/g 的细菌［34］。然而即便有这么高的定植水平也不一定能引起宿主疾病，空肠弯曲菌可在鸡体内以某种共生关系存在，其原因仍不清楚，推测可能由于鸡宿主存在针对空肠弯曲菌毒力因子的特异性表达或者缺少毒力因子的特异性受体。Nachamkin 等［35］实验认为这与鸡的肠粘液有关，Hemdrixson 等［36］实验表明编码空肠弯曲菌甲基受体趋化性蛋白(MCP)的两个基因在细菌和鸡的共生关系中发挥非常重要的作用。也有少量报道指出鸡在实验性感染某种血清型空肠弯曲菌后可出现腹泻、肝炎、少数死亡以及神经系统的疾病［37］。可见鸡疾病的产生与鸡的年龄、免疫状态、遗传背景、以及感染菌株等相关，禽鸟类的胃肠道和免疫系统与人类存在差异，它们之间的关联性有待探究。

6.2 鸡定植模型

利用鸡定植模型研究空肠弯曲菌假定的定植因子获得了成功，该模型不仅可成为今后功能基因组学研究的重要工具，还可为制定如何减少食物链中弯曲菌污染方案提供依据。Cawthraw 等［38］利用空肠弯曲菌标准株81116 感染鸡模型制定出了定植能力－接种剂量的标准曲线。应用该模型已经成功评价了多种空肠弯曲菌突变株和分离株定植肠道的能力，证实了包括flaA、flaB、sod、cat、regX、FlgR、cadF、cjaB、σ54、σ28 在内的多种基因和因子在定植中的作用。随着鸡定植模型研究的深入，空肠弯曲菌中更多的与肠道定植相关的因子不断在该模型中被证实［39-40］。

7 展望

空肠弯曲菌定植与宿主的病理反应是多种因素作用的结果，虽然不断有新的参与定植或病理反应的相关因子被发现，但仍有许多环节不清楚。目前最重要的是建立易于操作、重复性好、更类似人类病理变化的动物模型，以阐明细菌致病性以及与人类疾病的相关性。随着分子生物学和实验动物学技术突飞猛进的发展，新的实验动物模型必将被发现，而将来在建立空肠弯曲菌动物模型时需要注意的有:(1)建立可以保持或增强空肠弯曲菌毒力的培养方法;(2)培育与人类病理状态最为接近的SPF 级实验动物;(3)发展适用于空肠弯曲菌相关基因敲除的实验动物模型、转基因动物模型、人体组织异种动物移植模型是今后的重要方向。

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