全氟辛烷磺酰基化合物对剑尾鱼肝脏抗氧化物酶活性的影响

张晶，方展强

(1.华南师范大学生命科学学院，广东省高等学校生态与环境科学重点实验室，广州 510631;2.佛山环境健康与安全评价研究中心，广东 佛山 528000)

全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)是多种全氟化合物的重要前体和最终降解产物，被广泛应用于民用和工业各领域。PFOS 具有非挥发性、难降解性、广泛存在性和生物蓄积性等特性，因此作为新型持久性有机污染物，其环境行为、生态安全评价和毒性研究已引起科学家的广泛关注。多项毒理研究显示，PFOS 能够引发机体肝脏病变，破坏干细胞膜的完整性;引起胚胎畸形、新生胎儿死亡等胚胎毒性;导致中枢神经系统病理性改变;干扰内分泌，诱导雌激素效应，精子数量和活动率降低;诱导骨髓细胞微核数升高等一系列反应［1-5］。

抗氧化物酶系统对各类污染物胁迫相当敏感，其活性变化可以为机体氧化应激提供敏感信息。目前，抗氧化物酶系统已被用于评估PFOS 毒性的研究中。但多数研究集中在分子转录水平和体外实验—细胞水平［6］的反应，不能够准确反映机体内复杂生理条件下对毒物的反应。因此，本实验通过对短期PFOS 暴露后剑尾鱼肝脏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛等几个指标的测定，研究高浓度PFOS 对剑尾鱼肝脏氧化损伤的程度，从自由基学说初步探讨PFOS 对鱼类可能的致毒机理，弥补此类物质在水生生物毒性资料上的缺乏，为进行生态风险评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

剑尾鱼购自广州花地湾花鸟鱼虫市场。选择健壮，体长4 ～5 cm 的幼鱼，购买后在实验室驯养一周以上。暂养期间死亡率低于3%;实验前一天停止投饵，选择体型正常，反应灵敏，大小基本一致，外观上没有异常现象的幼鱼随机分组。实验鱼的使用及实验过程“参照实验动物使用的3R 原则进行”［7］。

1.2 实验药品和仪器

邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等试剂均为分析纯，购自广州威佳科技有限公司。全氟辛磺酸钾盐(heptadecafluorooctanesulfonic acid potassium salt，Sigma-Aldrich 公司，美国)，纯度＞98%。用去离子水配制400 mg/L 的母液，使用时稀释成所需要的浓度。UV2300 分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)。DK-8D 型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)。

1.3 染毒实验设计

本文参考相关文献［6，8］，设计3.5、7.0、14.0 mg/L 和28.0 mg/L 四个处理组和一个对照组，同时设有平行组。实验用水为充分曝气的自来水，水温保持在26 ～28℃，pH 值为6.8 ～7.2。每组水量为20 L，放入剑尾鱼30 尾。实验期间各组未出现死亡现象。每组分别于12、24、48h 和96 h 取出剑尾鱼肝脏，每次每组每个时间点随机取出6 尾，分别将2尾鱼肝脏混合成一个样本进行测定，每组每个时间点共有3 个平行样本。肝脏取出后，用预冷的0.86%生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重后装袋密封，放入-70℃冰箱中保存备用。

1.4 样品酶液制备

组织样品在4℃下解冻，按照体积∶重量(V∶W)为10 ∶1 的比例加入冰冷的Tris-蔗糖缓冲液(pH 7.5)，用电动匀浆器匀浆，将匀浆液于4℃，10 000 r/min离心15 min。取上清用于SOD、CAT、GSH-PX 活性和MDA 含量测定。

1.5 抗氧化物酶活性测定

SOD、CAT、GSH-PX 及MDA 的测定均严格按照试剂盒说明进行:SOD 活性采用邻苯三酚自氧化法［9］测定;CAT 参照紫外分光光度法进行［10］;GSHPX 活性采用DTNB 法［11］;MDA含量采用TBA法［12］测定。其中SOD、CAT 和GSH-PX 中蛋白含量按照考马斯亮兰法测定，MDA 蛋白含量按照Folin-酚试剂法进行。

1.6 数据分析

实验结果表示为平均数± 标准误差(Mean ±SDE)。使用SPSS 16.0 统计软件ANVOA(单因素方差分析)对组间数据进行分析，P ＜0.05 表明差异显著，P ＜0.01 表明差异极显著。

2 结果

2.1 PFOS 对剑尾鱼肝脏SOD 活性的影响

剑尾鱼暴露于PFOS 12 h 后，3.5、7.0 mg/L和14.0 mg/L 处理组与对照组相比，SOD 活性无显著性差异，但28.0 mg/L 组出现显著性抑制，其抑制率为24%;到24 h 时，各个处理组SOD 活性出现不同程度的诱导，其中7.0、14.0 mg/L 和28.0 mg/L 组能极显著诱导SOD 的活性，诱导率分别为18.9%、17.7%和44.2%，此时28.0 mg/L 组达到SOD 活性诱导的第一个高峰;随着暴露时间的延长，除28.0 mg/L 组降低到对照组水平之外，其余各组SOD 活性继续上升，与对照组相比，均达到显著或极显著水平;到96 h 时，28.0 mg/L 组SOD 活性迅速上升到第二个高峰，其诱导率为62.0%，其他各组SOD 活性继续维持在较高水平。由此可见，3.5 ～14.0 mg/L 组SOD 活性主要表现为诱导作用(图1)。

2.2 PFOS 对剑尾鱼肝脏CAT 活性的影响

图1 PFOS 对剑尾鱼肝脏SOD 活性的影响Fig.1 Effects of PFOS on the hepatic SOD activity in the swordtails

从图2 可以看出，同一时间CAT 活性与对照组相比，随着PFOS 浓度的增高，其活性呈不断下降趋势。其中，28.0 mg/L 组CAT 活性最低。12 h 时，除3.5 mg/L 组，其余各组CAT 活性被显著或极显著抑制，其抑制率分别为35.7%、53.4%和68.7%;到24 h 时，各浓度组呈上升趋势，但仍然低于对照组，其中，3.5 mg/L 和14.0 mg/L 组CAT 活性达到最高值，分别为23.094 U/mg 和18.546 U/mg，各处理组抑制程度有所减轻，与对照相比差异无显著性;48 h 时，14.0 mg/L 和28.0 mg/L 组CAT 活性被显著性抑制，其抑制率为41.8%和49.1%;随着时间的延长，到96 h 时，各处理组CAT 活性呈下降趋势，恢复到12 h 水平，其中28.0 mg/L 组呈显著性抑制。

图2 PFOS 对剑尾鱼肝脏CAT 活性的影响Fig.2 Effects of PFOS on the hepatic CAT activity in swordtails

2.3 PFOS 对剑尾鱼肝脏GSH-PX 的影响

GSH-PX 活性变化与CAT 活性变化趋势相似。同一时间各处理组GSH-PX 活性随着PFOS 浓度的升高而降低。12 h 时，除3.5 mg/L 组，其余各组与对照组相比均被极显著抑制，其抑制率分别为45.7%、58.1%和62.1%;到24 h，各处理组GSHPX 活性均有不同程度的升高趋势，其中3.5 mg/L、7.0 mg/L 和28.0 mg/L 组活性达到高峰，但仍然低于对照组，两个高浓度组GSH-PX 活性与对照组相比差异有极显著性;14.0 mg/L 组GSH-PX 活性上升趋势一直延续到48 h 才达到最高点，为22.284 U/mg，而此时，其余各组GSH-PX 活性开始呈下降趋势;随着暴露时间的延长，到96h 各处理组被显著或极显著抑制。值得注意的是，28.0 mg/L 组各时间均被极显著抑制，并在96h 时抑制率达到最高值64.8%(图3)。

图3 PFOS 对剑尾鱼肝脏GSH-PX 活性的影响Fig.3 Effects of PFOS on the hepatic GSH-PX activity in the swordtails

2.4 PFOS 对剑尾鱼肝脏MDA 的影响

剑尾鱼暴露于PFOS 中12 h 时，各处理组随着浓度的升高，MDA 含量呈小幅下降趋势，其中14.0 mg/L 组与对照组相比差异显著;随着暴露时间的延长，各处理组的MDA 含量在24 h 和48 h 都有不同程度的升高，但上升幅度与对照组相比差异无显著性;这种上升趋势一直保持到96 h，并达到最高点，除14.0 mg/L 组的MDA 含量被显著诱导外，其他各组均被极显著诱导，诱导率分别为71.2%、70.1%和85.1%(图4)。

3 讨论

3.1 PFOS 浓度对剑尾鱼暴露期间死亡率的影响

与黑头呆鱼、蓝鳃鱼和虹鳟PFOS 暴露96 h 的半数致死浓度相比，本实验采用的14.0 mg/L 和28.0 mg/L 是其1 ～2 倍，而与罗非鱼和大西洋鲑鱼原代肝细胞培养所暴露的浓度相当。实验期间，各处理组未发现死亡现象。其原因可能是种属差异、暴露途径和方式等不同造成的。

图4 PFOS 对剑尾鱼肝脏MDA 含量的影响Fig.4 Effects of PFOS on the hepatic MDA content in the swordtails

罗非鱼原代肝细胞暴露于15 ～30 mg/L PFOS 24 h 时，才能显著诱导SOD 和CAT 活性，而抑制GSH-PX 活性［6］;大西洋鲑鱼原代肝细胞暴露于25 mg/L PFOS 24 h 时，大部分基因(包括GSH-PX mRNA)才可发生显著变化［8］。而在本实验中，7.0 mg/L PFOS 暴露24 h，可显著诱导剑尾鱼肝脏SOD 活性，而CAT 和GSH-PX 活性在该浓度下12 h 时就已被显著性抑制。由此可见，无论是暴露时间还是浓度，鱼类本身对PFOS 浓度的敏感性要高于体外实验。这与关于鱼类细胞系对化学污染物急性毒性浓度的敏感性要低于动物本身的推论相吻合［13］。大马哈鲑鱼原代肝细胞暴露于2.1 ～25 mg/L PFOS 24 h 后未发现细胞活力的下降，推测原代培养的肝细胞对PFOS 敏感度低的结论也证实了这一点［14］。因此，这可能是在生物体内更为复杂的生理环境下，PFOS 进行其他反应有关。

3.2 PFOS 对剑尾鱼肝脏SOD 活性的影响

SOD 作为抗氧化防御系统的第一道防线，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应生成过氧化氢和氧气［15］。本研究结果表明，28.0 mg/L 组在12 h被显著性抑制，可能是由于高浓度PFOS 刺激下，机体产生氧化应激，生成过多的超氧阴离子自由基，而此时抗氧化防御系统未能及时增强SOD 活性进行清除。随着暴露时间的延长，除28.0 mg/L 组外，其余各处理组呈现不同程度的升高趋势，并在48 h 时诱导率达到最高值，到96 h 时虽然这3 组SOD 活性升高趋势幅度不大，但仍高于对照组。Stebbing 的毒性兴奋效应认为毒物在低浓度下导致生物体酶活性升高，而高浓度则导致酶活性降低［16］。但是在本研究中高浓度下也表现为SOD 活性升高，这与鲤鱼肝脏SOD 活性只有在高浓度喹乙醇暴露下才能被诱导的结果相一致。这种SOD 活力的持续升高对降低PFOS 对组织细胞的氧化损伤作用有一定作用，在防御组织氧化损伤方面可能是一种主动的也是有效的途径［17］。

值得注意的是在本研究中，28.0 mg/L 组SOD活性变化幅度较大，呈现先上升再下降最后上升的变化趋势，分别在24 h 和96 h 达到最高点，出现“双峰”现象。研究者推测PFOS 进入生物体后主要分布在肝脏的特性可能是由于PFOS 通过肠肝循环进行消除，即PFOS 经胆汁排泄后进入十二指肠，经小肠上皮细胞被重新吸收通过肝脏［18］，这种循环增加了化合物在体内的持久性和肝损伤。在药动力学上表现为药时曲线(药物吸收后在血浆中的总浓度随时间变化的曲线)，出现双峰现象。因此，推测28.0 mg/L 组SOD 活性变化可间接反映PFOS 在体内的消除循环过程。并且认为PFOS 导致的氧化应激可能是一种次生效应［14］。这种次生效应可能与PFOS 在体内的消除循环有关。暴露初期PFOS 刚刚进入剑尾鱼体内，由于应激反应产生氧自由基，一定量的超氧阴离子可诱导SOD 活性的升高;随着暴露时间的延长，体内PFOS 在肝脏中不断累积，并通过胆汁排泄，因此血浆中PFOS 浓度有所降低，诱导产生的氧自由基也随之降低，相应SOD 活性也降低到对照水平;但是PFOS 进入小肠后被上皮细胞重新吸收，使得PFOS 在血浆中浓度再次回升，最终导致SOD 活性的升高。

3.3 PFOS 对剑尾鱼肝脏CAT 活性的影响

CAT 主要分布在过氧化物酶体中，其作用是清除过氧化物酶体内长链脂肪酸代谢产生的过氧化氢［19］。研究表明，PFOS 暴露于30 mg/L 组时能显著提高罗非鱼原代肝细胞CAT 活性［6］，但是不能显著诱导鲤鱼肝脏CAT 的活性［2］。对硫磷600［20］和微囊藻毒素RR［21］也均能诱导鱼类组织中CAT 活性。但是，17β-雌二醇腹腔注射10 d 后导致齿舌鲈鳃中CAT 活性下降［22］，这与本研究结果相一致。同一时间PFOS 暴露下，CAT 随着浓度的上升而下降。在28.0 mg/L 最高浓度组与对照组相比达到显著或极显著水平。并且CAT 活性始终保持在较低水平。由图1 可知，SOD 活性始终被诱导，高于对照组。由此可见，SOD 高活性必然由于高浓度超氧阴离子的不断产生，认为超氧阴离子能够灭活CAT和GSH-PX 活性［23］。因此，CAT 活性在高浓度超氧阴离子存在下必然维持在较低水平。还可能是PFOS 直接作用于CAT，使酶的结构和功能发生改变。另外，随着暴露时间的延长，CAT 活性表现为先升高后降低趋势，但是这种时间上的变化对CAT活性影响不大。

3.4 PFOS 对剑尾鱼肝脏GSH-PX 的影响

GSH-PX 是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢和消除氢过氧化物的酶。研究表明，唑螨酯［24］和全氟十二酸［25］可导致鱼类肝脏GSH-PX 活性在暴露初期显著升高，后期迅速下降。而2，4-二氯苯酚暴露后导致金鱼肝脏GSH-PX 活性开始被抑制，但10 d 后又被显著诱导［26］。本研究中，PFOS暴露后，剑尾鱼肝脏GSH-PX 与CAT 活性变化趋势相一致。即同一时间不同浓度暴露下，GSH-PX 活性随PFOS 浓度升高而降低，推测可能也是与超氧阴离子灭活GSH-PX 有关。氧自由基可使GSH-PX氨基酸残基氧化产生羰基［27］，蛋白羰化是不可逆反应，一旦形成将导致酶构象变化，降低酶的催化活性和最终产物［28］。GSH-PX 活性的降低也暗示着脂质过氧化产物产生的速度超过其清除能力。已经发现30 mg/L PFOS 暴露后使得罗非鱼原代肝细胞GSHPX 活性下降，这与本实验结果相吻合［6］。随着暴露时间的延长，同样没有时间对活性影响的效应。

值得注意的是，96 h 3.5 mg/L PFOS 就可显著抑制GSH-PX 活性，并且14.0 mg/L 和28.0 mg/L组个各时间GSH-PX 活性与对照组相比均被显著或极显著抑制。由此可见，GSH-PX 对PFOS 的敏感性要高于CAT。有学者发现2，4-二氯苯酚暴露后金鱼肝脏中GSH-PX 比CAT 更多的在肝细胞解毒过程中发挥作用［26］。并且认为在动物细胞中，抗氧化物酶系统中长期清除过氧化氢的酶是GSH-PX，而CAT 与过氧化氢的相关性要弱于GSH-PX［29］。除此之外，这可能还与GSH-PX 具有清除氢过氧化物的功能有关。

3.5 PFOS 对剑尾鱼肝脏MDA 含量的影响

MDA 是脂质过氧化的代谢产物，其含量高低可间接反映机体氧化损伤的程度。脂质过氧化被认为是氧化应激导致细胞丧失功能的主要原因［30］。并且脂质过氧化对水生动物而言至关重要，因为细胞膜在正常状况下所含不饱和脂肪酸数量高于其他物种［31］。一旦发生过氧化反应，细胞膜的结构和功能就会遭到严重损伤。研究发现，欧鲫、鲤鱼、黑头呆鱼、鳗鱼和虹鳟暴露于PFOS 后可导致肝细胞膜结构和功能紊乱［32，33］。本研究表明，各浓度组MDA含量随着暴露时间的延长而增高，在96 h 时MDA含量达到最高值，与对照组相比呈显著或极显著水平。这与GSH-PX 在96 h 时各组显著性抑制的结果是相互印证的。由此可见，随着实验时间的延长，PFOS 诱导产生的大量活性氧，超过了机体清除活性氧的能力，使大量活性氧作用于细胞膜，破坏细胞的完整性，最终导致细胞的氧化损伤。PFOS 暴露12 h时，MDA 含量随浓度升高而呈小幅下降趋势，并在14.0 mg/L 组时与对照组相比差异显著。这可能是由于PFOS 刚刚进入剑尾鱼体内导致生物代谢或其他生理因素发生改变而非氧化应激的结果，其相关机制有待进一步研究。

4 结论

综上所述，剑尾鱼自身耐受PFOS 的敏感性要高于其他鱼类的体外实验。PFOS 暴露后，剑尾鱼肝脏中抗氧化物酶活性发生明显变化。SOD 活性始终被诱导，维持在较高水平，可能是组织在防御氧化损伤方面作出的一种更为主动有效的途径。28 mg/L 组SOD 活性的变化趋势可间接反映机体内PFOS可能通过肠肝循环进行消除。SOD 的高活性是由于机体中超氧阴离子的存在，而高浓度的超氧阴离子能够灭活CAT 和GSH-PX 活性，因此，CAT 和GSH-PX 活性始终低于对照组，并且发现GSH-PX对PFOS 的敏感性高于CAT。最后，MDA 含量持续升高反映出细胞已经遭受到氧化损伤。因此推测氧化应激是PFOS 对水生生物致毒的重要途径之一。

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