白念珠菌肺部感染动物模型

许 群 眭 建 (江苏大学临床医学院，江苏 镇江 212001)

侵袭性真菌感染近年有明显的上升趋势，其主要原因是临床上长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂，放化疗的综合应用及艾滋病的流行，致使人体的正常菌群失调，机体免疫功能减低，外源性真菌乘虚侵入或内源性真菌在体内生长繁殖而引发感染〔1〕。国内外报道引起感染的真菌种类主要有念珠菌、曲霉菌、隐球菌、毛霉菌等，其中白念珠菌的感染最多见〔2，3〕。白念珠菌致病具有多变性，包括念珠菌血症、外阴阴道念珠菌病(VVC)〔4〕、皮肤黏膜念珠菌病、脏器感染等，其中呼吸道感染发病率最高〔2〕。侵袭性肺部真菌感染的临床及影像学表现缺乏特异性，难以获得组织和病原学的证实，病情易被原发病或其他并发症掩盖，造成误诊、漏诊，从而延误治疗;未及时处理的肺部真菌感染患者的病死率可达30% ～80%〔5〕。因此，建立相应的真菌模型用于研究相关指标，指导临床实践，能为改善真菌感染现状提供可能。

1 模型的建立

目前用于白念珠菌模型研究的动物主要有小鼠、大鼠、豚鼠、兔及基因敲除鼠。实验动物白念珠菌感染途径主要有经口腔灌喂、呼吸道、阴道、腹腔及静脉系统途径接种。肺部真菌感染的模型，大多数通过呼吸道建立，如气管切开接种法和滴鼻法，也有采用静脉接种建立系统性感染模型。有研究者采用密闭空间分生孢子吸入感染的方法，成功建立了免疫抑制小鼠的肺部曲霉菌感染模型〔6〕。其中，经气管切开接种法建立的模型虽成功率较高，但是操作繁琐且实验动物伤害严重，对动物耐受性要求高。

2 白念珠菌致病机制

2.1 宿主因素 真菌极少引起健康和具有免疫能力的个体的疾病，即使不断暴露于具有传染力的繁殖体。宿主主要通过多种不同的保护机制来阻止真菌入侵，皮肤黏膜的完整性，机体自身产生的长链不饱和脂肪酸，标准菌落的pH竞争，上皮更新及角质层的自然干燥阻止了真菌的生长。其他组织像毛细支气管，胃肠道和阴道穹窿则通过体液中的黏膜上皮细胞含有的抗菌物质或通过纤毛清除异物起作用。

白念珠菌是引起侵袭性真菌感染最主要的病原菌。新生儿在分娩过程中通过阴道腔时最先接触白念珠菌，在此过程中念珠菌便寄生在新生儿的口腔前庭和部分胃肠道内，并终生携带，但是在正常机体内一般不致病。当白念珠菌在偶然穿过宿主的皮肤和黏膜屏障且感染的数量及毒力到达一定程度，或者宿主免疫缺陷时，才会引起机体感染。细胞免疫缺陷的病人皮肤黏膜易感染，但并不发展成念珠菌血症，相反全身性的感染更易发生在嗜中性白细胞减少症或嗜中性粒细胞失调的病人〔7〕。局限于肺部的白念珠菌病少见，常见的是念珠菌血症引起的多脏器念珠菌病，并包括肺部。

2.2 菌体因素 有研究表明〔8〕，白念珠菌致病主要与黏附能力、受体形态转化、胞外酶等有关，其分泌的毒素和水解酶，有破坏组织的能力。念珠菌黏附到宿主细胞表面是致病的首要条件，菌体可广泛黏附于上皮细胞、血管内皮细胞及细胞外基质等通过多种途径引起局部或播散性感染〔9〕。白念珠菌可存在于多种形态，包括菌丝、假菌丝和酵母形式，从酵母到丝状形态过渡的能力与毒力相关〔10〕。细胞外水解酶中，分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)是潜在的毒力因素，已知SAP能降解细胞外基质、角蛋白及免疫球蛋白等，为白念珠菌提供营养，并促进白念珠菌黏附上皮细胞，侵入宿主造成组织损伤及协助其逃逸宿主防御机制〔11〕。另外〔12〕，念珠菌菌体成分可激活补体旁路途径，产生补体趋化因子和过敏毒素，导致局部水肿和炎细胞浸润。真菌腺嘌呤环化酶Cyr1p是cAMP/PKA信号传导通路的一个关键组成部分，该通路控制着不同的相关感染性状，包括菌丝的形态形成。然而，目前有关血清菌丝诱导特点及其真菌传感器的机制仍属未知。Xu等〔13〕的分析结果表明，活化血清的组分中含有细菌的类肽聚糖(PGN)分子，而有几个纯化和合成的胞壁酰二肽(MDPs)与细菌的类肽聚糖的亚基能够有效地促进白念珠菌的菌丝生长。通常情况下，核苷酸结合寡聚化结构域蛋白Nod1和Nod2可以通过富含亮氨酸的重复序列(LRR)域识别 PGN的类似物，研究者发现，胞壁酰二肽(MDPs)可以通过直接与其LRR域结合来激活Cyr1p。另有研究发现亦可直接激活Cyr1p催化结构域〔14〕。

3 白念珠菌肺部感染动物模型的应用

3.1 免疫学研究 在机体抗真菌感染中，病原识别受体(PRR)对其进行识别并启动固有免疫，Toll样受体(TLRs)是最重要的PRR之一。真菌侵入机体后，主要由TLR2和TLR4等通过识别不同的病原相关分子模式(PAMPs)，启动固有细胞免疫，巨噬细胞和中性粒细胞被激活并释放细胞因子和炎症介质。TLR4主要识别白念珠菌壁上的甘露聚糖启动信号传导，而TLR2则主要识别β-葡聚糖介导细胞因子的分泌〔15〕。有研究发现〔16〕感染白念珠菌的TLR4缺陷小鼠，巨噬细胞表现出较低的吞噬作用并且趋化因子CXCL1、白介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平较低，表明TLR4对巨噬细胞识别白念珠菌的感染至关重要。

宿主巨噬细胞通过呼吸爆发和释放细胞因子吞噬并杀灭入侵的白念珠菌，而抗原递呈细胞(APCs)对念珠菌抗原进行加工并迁移至淋巴结，在MHC-Ⅱ类分子的作用下向CD4+T亚群细胞分化，进而进一步分化为TH 1和TH 17型细胞〔7〕。白介素-17(IL-7)是TH 17细胞产生的最主要的细胞因子，研究发现人外周血中分泌的IL-17为CCR6+CD4记忆性T细胞，通过对其细胞抗原特异性的分析，TH 17细胞可能在真菌感染中发挥重要作用〔17〕。IL-17可以产生类似于 IL-1β、TNF-α或脂多糖(LPS)的作用，诱导炎症反应的细胞因子产生，IL-17A敲除的小鼠，其嗜中性粒细胞到达感染组织的数量减少〔18〕。在大鼠支气管肺白念珠菌感染模型的研究中，发现IL-17的水平与机体炎症反应呈正相关，可能通过促进中性粒细胞在气道的聚集参与炎症反应〔19〕。TH 1细胞分泌的 γ-干扰素(IFN-γ)与白介素-12(IL-12)，可激活巨噬细胞并加强机体对再感染念珠菌的抵抗力。另外，CD4+th1还可诱发迟发型超敏反应，控制真菌感染的扩散。傅颖媛等〔20〕研究发现，在Balb/c小鼠白念珠菌感染早期多以TH 1型细胞应答为主，后期TH 1/TH 2型细胞因子均升高，示体液免疫也参与了机体抗感染。

3.2 指导临床诊断 Mitra等〔10〕报道了一种新的进行性白念珠菌系统性感染的成像模型，试验者在小鼠体内接种标记了绿色荧光蛋白(GFP)的白念珠菌，能在共焦显微镜下显示体内形成的系统性感染状态，进而观察到丝状体的生长及微脓疡在小鼠体内的形成。谢丽璇等〔21〕发现在免疫抑制的新西兰兔肺白念珠菌病模型中，胸部CT表现多样，其中实变最多见，其次为磨玻璃、结节影，各种征象可单独发生，亦可组合发生，为临床影像学诊断肺部白念珠菌感染提供了参考。

3.3 疫苗研制 目前认为治疗白念珠菌除了抗真菌药物外，还需使机体处于高免疫状态，有效的疫苗可以大大降低真菌感染率和死亡率。疫苗要应用于临床，必须首先在动物模型上进行大量的实验来证实其有效性。近年来研究的白念珠菌疫苗主要有:菌体灭活疫苗，但效果并不十分有效;DNA疫苗，其免疫原性并不清楚，主要还处于动物研究阶段;亚单位疫苗，即将念珠菌中的特异性抗原进行提纯，制成疫苗。另外还有P43疫苗、杀伤细胞毒素疫苗及以DC为基础的“佐剂”型疫苗等，但对于疫苗的作用机制和人体安全性仍然需要进一步研究〔22，23〕。李丽波等〔24〕在进行系统性白念珠菌感染小鼠研究中，发现卡介苗提前免疫组的存活期时间及肾组织菌落计数较生理盐水对照组有明显改善。

3.4 抗真菌药物实验 目前较有效的抗真菌药物有氟康唑、两性霉素B脂质体、伊曲康唑、卡泊芬净及米卡芬净等，临床上大多根据经验用药。但由于现有药物的不良反应、大量耐药白念珠菌菌株和新菌株的出现以及复发率的上升，使得研究和开发新型药物不容松懈。细胞因子作为一种抗真菌感染的辅助治疗因子，已经受到越来越多研究者的关注。IFN-γ、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-12及TNF-α在动物感染模型中有较好的抗菌作用。特别是抗真菌药与细胞免疫因子联合应用时不仅能提高疗效，而且还能降低耐药性和潜在毒性〔25〕。最近，Tsai等〔26〕研究发现白介素-37(IL-37)能通过优先结合白念珠菌细胞壁上的主要成分甘露聚糖来发挥对菌体黏附和聚集的抑制作用，为防治白念珠菌感染提供了一种新的策略。在抗白念珠菌感染的研究中，越来越多的中药被发现有较好的抗真菌作用，有试验者〔27〕发现大蒜素注射液能提高正常感染及免疫抑制感染状态下小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖活性和IFN-γ水平。另在参芪扶正液辅助治疗肺白念珠菌感染的实验研究中，发现其与抗真菌药伍用可提高感染小鼠的生存率，增强抗真菌药物的疗效〔28〕。

4 讨论

在白念珠菌感染的研究中，动物模型广泛被应用，并也取得了一定的成果，但多是研究真菌的致病机制及抗真菌药物的研发。而临床上侵袭性肺部真菌感染没有特征性，易被原发病或继发细菌、病毒感染的表现掩盖，且与其他肺部感染疾病的鉴别诊断不明确，早期诊断十分困难。传统的真菌培养阳性率较低且耗时长，即使阳性有时也难以确定是定植、污染或感染;病理学检查结果虽可靠，但属于有创检查，患者较难接受。一些新兴的血清学和分子生物学诊断方法虽可用于早期诊断，但是敏感性和特异性的结果并不理想。肺部真菌感染的病人经确诊时往往感染较严重，加之本身机体状态比较差，故感染较难控制。发病率和死亡率居高不下的现状迫切需要新的诊断方法来获取更多的信息，譬如借助动物模型进行疾病的发展过程和影像学等方面的研究，进一步完善各项指标，建立一个标准化的诊断和治疗方案。

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