布鲁氏菌病实验室诊断技术的研究进展

赵洪进，屠益平，沈素芳，孙泉云，夏炉明，唐文红，刘佩红

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

布鲁氏菌病是由布鲁菌引起的一种重要人兽共患病，在世界各地广泛流行。近年来，我国畜间和人间布鲁氏菌病均呈现明显上升趋势，给畜牧业和人民身体健康造成了巨大损失。及时准确诊断是防治布鲁氏菌病的一个有效手段，100多年来，各国学者进行了大量研究和探索，其中实验室诊断技术得到了快速发展和广泛应用。本文就布鲁氏菌实验室诊断技术研究进展作一简要综述。

1 病原学诊断

1.1 染色镜检

采集流产胎衣、绒毛膜水肿液、肝、脾、淋巴结、胎儿胃内容物等组织，制成抹片，用柯兹罗夫斯基染色法染色，镜检，布鲁氏菌为红色球杆状小杆菌，而其它菌为蓝色。该方法常应用于对流产物质的分析，但不具有特异性，因为一些导致流产的病原体如流产衣原体以及贝氏立克次氏体也能够被染成红色。

1.2 分离培养

布鲁氏菌可以用胰蛋白胨琼脂、血液琼脂、肝汤琼脂等培养基进行分离培养，通过菌体形态、染色特征、菌落形态、生长特性、生化反应特点以及布鲁氏菌多克隆抗体凝集试验等方法进行鉴定。布鲁氏菌的分离培养是诊断布鲁氏菌病的“金标准”，但是由于布鲁氏菌的分离率较低、所需时间较长（至少3～8天，有时甚至达45天）、生物安全要求较高，因此不适合普遍应用。

1.3 分子生物学检测

布鲁氏菌分子生物学检测技术是近年来的研究热点，它可以从多方面揭示布鲁氏菌各型之间的区别和关联，目前主要有DNA同源性测定、多种PCR分析、核酸探针、环介导等温扩增等技术。

1.3.1 DNA同源性测定 布鲁氏菌最早通过测DNA（G+C）mol%值以及染色体大小的方法来区分。对微生物来说，DNA（G+C）mol%值和染色体大小一般是恒定的。经过测定发现布鲁氏菌各型之间表现为高度同源性，甚至有学者提出布鲁氏菌只有一个种属。通过这种检测方法只能确定菌属，对于布鲁氏菌各型的区分则无能为力，加之方法繁琐、费用高，不适合普通实验室应用。但是这些方法是布鲁氏菌基因研究的一些基础工作，为后来的分子生物学技术奠定了基础。

1.3.2 PCR技术 随着分子生物学技术的发展，PCR技术逐步成为布鲁氏菌检测的重要手段。自1990年Feteke等[1]首次应用PCR技术诊断布鲁氏菌病以来，该项技术得到了快速发展。PCR研究方法很多，可以归纳为单对引物PCR、多重PCR、实时PCR等。单对引物PCR较早用于布鲁氏菌属的检测，检测所使用的扩增模版和手段很多，常选用的有16SrRNA、IS711、VirB8、bcsp31、外膜蛋白 omp2b、omp2a、omp31和omp25等。Imaoka等[2]以bcsp31基因和三种外膜蛋白基因（omp2b，omp2a，omp31）为靶基因，设计4对引物进行PCR反应，对羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌及犬种布鲁氏菌进行了检测。Ouahrani-Bettache等[3]根据IS6501在不同种及生物型布鲁氏菌基因中的位置及数目不同，设计了IS6501锚定PCR，该方法不仅可以区分不同的布鲁氏菌种，而且可以区分野毒株和A19疫苗株，对于流行病学调查有着非常重要的意义。尽管单对引物PCR可以检测到任何含有布鲁氏菌DNA的标本，应用范围较传统血清学方法和微生物方法更为广泛，但是对于布鲁氏菌的生物型，只使用单对引物是无法做到完全区分的，有的甚至是不能区分的。单对引物方法具有局限性，而拥有多个引物的多重PCR可以将布鲁氏菌鉴定到生物型的水平。Bricker等[4]建立了AMOS（abortus melitensis ovis suis）PCR，是最早建立的多重PCR方法。该试验可以鉴别牛种1、2和4型，羊种1、2、3型，绵羊副睾种和猪种1型布鲁氏菌。后来Ewalt等[5-6]两次改进了AMOS PCR，使该法可以鉴别的菌种类型进一步完善。国内钟旗等[7]应用AMOS PCR开展了布鲁氏菌种型鉴定研究，结果表明该方法的特异性、敏感性均高于细菌分离和血清学诊断方法，且能区分各种和部分生物型。实时（Real-time）PCR是新近发展的分子生物学技术，其最突出特点是快速、无需电泳并能避免污染。Redkar等[8]于2000年应用Real-time PCR鉴别了牛种、羊种、猪种布鲁氏菌3个种。刘志国等[9]建立的基于TaqMan探针的多重实时荧光PCR方法能快速检测布鲁氏菌的同时并可以确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。PCR技术除了可以应用于布鲁氏菌种属的区分鉴别以外，还可以根据某些特定的序列描述新种和菌株特征。Cloeckaert等[10]用PCR方法扩增布鲁氏菌的BP26基因，得到1 029 bp和1 900 bp，1 029 bp是所有布鲁氏菌的6种共有的序列，而1900bp是海洋种布鲁氏菌特有的产物。他还检测了7个LPS-O链合成的相关基因，结果发现在粗糙型布鲁氏菌中不存在有意义的差异，据此他们认为omp2位点的RFLPPCR是一个首选的区分和鉴别布鲁氏菌以及描述新种和菌株特征的序列[11]。

1.3.3 核酸探针技术 依据核苷酸的严格配对发展起来的核酸探针杂交技术具有灵敏度高，特异性好，一次性可以检测大量样本的优点，该方法操作简便，不需要特殊的仪器设备，适合用于临床样本的检测和流行病学调查。探针可以重复多次利用，大大降低了检测的成本。该方法不仅可以诊断布鲁氏菌病还可以鉴定布鲁氏菌的不同种型，是临床应用的一种重要的诊断方法。Fernander等[12]以牛种布鲁氏菌16SrRNA序列制备荧光寡核苷酸探针，对所有种型的代表菌株以及9株不同的临床分离株进行杂交检测，结果该方法可将猪种布鲁氏菌2、3、4、5生物型与其它种型布鲁氏菌鉴别区分开。

1.3.4 环介导等温扩增技术（LAMP）LAMP和PCR技术一样也是通过扩增布鲁氏菌的特异的序列对检测的病原作出诊断鉴定，但是PCR技术需要特殊的仪器设备，无法满足基层的要求，而LAMP以其简便、灵敏、快速、特异的优势被大量研究，并在多种病原微生物的感染诊断中得到了成功应用。新型可视化LAMP的出现使该方法的应用更加简便、安全，直接可以通过肉眼观察判定结果，很多实验室在LAMP应用于布鲁氏菌病的诊断中也进行了大量的探索。潘文等[13]根据布鲁氏菌种特异的omp25基因建立了应用于布鲁氏菌病检测的新型可视化LAMP，并用所建立的方法对布鲁氏菌S19株、S2株和M5株3株弱毒疫苗进行检测，均显示阳性扩增结果。许邹亮等[14]建立的LAMP最低检出限约为17 fg布鲁氏菌基因组DNA，显示了良好的灵敏性。可视化LAMP方法的特异性和灵敏性均比较高，阳性结果会直接产生颜色变化，检测结果无需开盖分析即可用肉眼观察获得，一步即可完成LAMP扩增及结果的判定，降低了布鲁氏菌造成的生物安全威胁，适合在基层广泛推广应用。

2 免疫学诊断

在布鲁氏菌病大规模检疫诊断中，免疫学方法仍是最常用的技术。目前常用免疫学方法主要包括虎红平板凝集试验（RBT）、全乳环状试验（MRT）、试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光偏振测试（FPA）、胶体金免疫层析法（GICA）等。

2.1 虎红平板凝集试验（RBT）

在免疫学方法中，RBT是最简单的方法。虎红平板凝集抗原是用抗原性较好的流产布鲁氏菌经培养、灭活并用虎红染色液染色，悬浮于乳酸缓冲液中制成，该方法灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验。

2.2 全乳环状试验（MRT）

MRT以染色的布鲁氏菌全菌作为诊断抗原，可用其检测混合奶样，当存在布鲁氏菌抗体时，红色的抗原抗体复合物转移到乳脂层，形成有色乳脂环（红色为紫红色）。MRT被认为缺乏敏感性，但由于检测成本低廉，这种缺陷可通过反复检测来加以弥补。OIE规定MRT只能用于奶牛检测。

2.3 试管凝集试验（SAT）

早在1897年SAT就已应用，时隔一百多年，该方法仍是免疫学诊断布鲁氏菌病的基石，在几个已宣称为“无布病”国家的布病根除运动中都得到了良好的应用，也是我国法定的诊断布鲁氏菌病的方法。该方法准确性高，可以半定量，具有较高的敏感性和特异性。但该方法繁琐费事，不适于现场操作，而且和RBT一样，容易出现假阳性或假阴性[15]。

2.4 补体结合试验（CFT）

CFT用于检测由抗布鲁氏菌抗体激活的补体，也是我国诊断布鲁氏菌病的法定诊断方法。该方法特异性较强，对于诊断牛、羊布鲁氏菌病的临床诊断有很高的价值，由于猪的补体会干扰豚鼠补体的作用，导致实验的敏感性降低，因此补体结合试验不适合猪布鲁氏菌病的检测。该方法的实验条件要求很高，过程十分复杂，难于标准化，正逐渐被ELISA所取代。

2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是20世纪70年代发展起来的一种新型布鲁氏菌病快速检测技术，具有很强的敏感性和特异性，敏感性比SAT高10～100倍，2000年，国际贸易组织将其列为检测牛布鲁氏菌病的指定诊断方法。目前常用的ELISA方法有间接酶联免疫吸附试验（iELISA）、竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）和斑点酶联免疫试验（Dot-ELISA）。Vanzini等[16]应用iELISA方法对奶牛布鲁氏菌病诊断效果进行了评价，结果表明，奶样敏感性为99.6%，特异性为99.1%；血清的敏感性为99.6%，特异性为98.6%。虽然iELISA是高度敏感的方法，但是它的缺点是不能分辨出接种牛种布鲁氏菌S19或羊种Rev1疫苗与自然感染产生的抗体[17]。因此，iELISA更多的应用于非免疫家畜普查检测而不是免疫家畜的诊断方法。竞争性抗体能有选择地抑制结合疫苗所产生的抗体而不是野毒株所产生的抗体，可消除因接种疫苗而产生的残余抗体所引起的大部分反应。Weynants等[18]以辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体12G12和羊种布鲁氏菌疫苗株Rev1的光滑型LPS建立了cELISA，并对936 份血清样本检测，结果证明其特异性高于CFT和RBT。2004 年，cELISA方法以其高特异性和敏感性的优点被OIE列为诊断和清除牛布鲁氏菌病的推荐方法。Chand等[19]将布鲁氏菌超声裂解抗原点在硝酸纤维素膜上作Dot-ELISA 检测牛布鲁氏菌抗体，结果表明该方法简单、快速、敏感性高，而且结果易于判定，适宜在广大基层单位应用。

2.6 荧光偏振测试（FPA）

FPA是一种利用物质分子在溶液中旋转速度与分子量大小呈反比的特点，定量检测抗原或抗体的一种分析方法。王玉玲等[20]应用荧光偏振检测方法对出口牛进行了布氏杆菌病检测，结果显示FPA从敏感性和特异性上都优于或等于目前主要采用的RBT、SAT、CFT、ELISA检测方法。FPA方法简便、快速、通量大，适合于大批量布氏杆菌病的检疫、筛查和疫病监控。FPA已用于北美和欧洲的布病根除运动，是OIE规定的“贸易适用”方法。

2.7 胶体金免疫层析法（GICA）

GICA是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术。用该技术检测组织切片中的菌体抗原，敏感性高于ELISA和PCR，最小检出量可达200 CFU/mL。朱晓东等[21]将布鲁氏菌可溶性抗原结合于硝酸纤维素膜上，结合羊抗人IgG 做标记抗体，建立斑点免疫金渗滤测定法，检测布鲁氏菌感染者血清抗体，结果免疫渗滤法敏感性为98%，特异性为100%。GICA 特异性、敏感性较高，而且简便快速，除试剂外不需任何仪器，比较适合于流行病学调查及野外现场检测。

3 结语

综上所述，目前国内外布鲁氏菌病的诊断方法较多，各种诊断方法也不能相互取代，但法定的检测手段仍以细菌学和常规免疫学检测为主。随着ELISA和分子生物学技术的快速发展，以其敏感性高、特异性强、操作简便快速的特点，逐渐成为布鲁氏菌病检测的重要手段，逐步在布鲁氏菌病防治方面发挥越来越大的作用。

[1]Fekete A，Bantle JA，Hailing SM，et al.Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction[J].Appl Bacteriol，1990，69（2）：216-227.

[2]Imaoka K，Kimura M，Suzuki M，et al.Simultaneous detection of the genus Brucella by combinatorial PCR[J].Jpn J infect dis，2007，60（2/3）：137-139.

[3]Ouahrani-Bettache S，Soubrier MP，Liautard JP.IS6501-anchored PCR for the detection and identification of Brucella species and strains[J].J Appl Bacteriol，1996，81（2）：154-160.

[4]Bricker BJ，Halling SM.Differentiation of Brucella abortus bv.1，2，and 4，Brucella melitensis，Brucella ovis，and Brucella suis bv.1 by PCR[J].J Clin Microbiol，1994，32（11）：2660-2666.

[5]Ewalt DR，Bricker BJ.Validation of the abbreviated Brucella AMOS PCR as a rapid screening method for differentiation of Brucella abortus field strains，19 and RB51[J].J Clin Microbiol，2000，38（8）：3085-3086.

[6]Bricker BJ，Ewalt DR，Olsen SC，et al.Evaluation of the Brucella abortus species specific polymerase chain reaction assay，an improved version of the Brucella AMOS polymerase chain reaction assay for cattle[J].J Vet Diagn Invest，2003，15（4）：374-378.

[7]钟旗，范伟兴，何倩倪，等.用AMOS-PCR对布鲁氏杆菌种型鉴定的研究[J].中国人兽共患病学报，2007，23（7）：683-686.

[8]Redkar R，Rose S，Bricker B，et al.Real-time detection of Brucella bortus，Brucella melitensis and Brucella suis[J].Mol Cell Probes，2001，15（1）：43-52.

[9]刘志国，罗成旺，张利，等.多重荧光定量PCR方法鉴定布鲁氏菌属及牛羊种布鲁氏菌研究[J].中国人兽共患病学报，2012，28（9）：869-874.

[10]Cloecaert A，Crayon M，Grepinet O，et al.An IS711 Element Downstream of the bp26 Gene Is a Specific Marker of Brucella spp.Isolated from Marine Mammals[J].Clin Diagn Lab Immunol，2000，7（5）：835-839.

[11]Cloecaert A，Crayon M，Verger J M，et al.Conservation of Seven Genes Involved in the Biosynthesis of the Lypopolysacchride O-side Chain in Brucella spp[J].Res Microbio，2000，151（3）：209-216.

[12]Farnander LL，Vallejo FJ，Trujilano I，et al.Fluorecent Wholecell Hybridization with 16S rRNA-targated Oligonucleotide Probes to Identify Brucella spp.by Flow Cytomety[J].Clin Microbiol，2000，38（7）：2768-2771.

[13]潘文，李珊珊，赵明秋，等.新型可视化LAMP检测布鲁氏菌方法的建立及初步应用[C]//中国畜牧兽医学会生物制品学分会.第三届中国兽药大会学术论坛论文集.北京：中国畜牧兽医学会生物制品学分会，2010：336-341.

[14]许邹亮，南文龙，周洁，等.布鲁氏菌环介导等温扩增（LAMP）可视化检测方法的建立[J].中国动物检疫，2011，28（8）：37-40.

[15]范伟兴，钟旗，何倩倪，等.几种布鲁氏菌病血清学诊断方法的比较研究[J].中国动物检疫，2006，23（6）：31-33.

[16]Vanzini V R，Aguirre W，Lugaresi C I，et al.Evaluation of an indirect ELISA for the diagnosis of bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina[J].Prev Vet Med，1998，36（3）：211-217.

[17]Nielsen KJ，Cherwonogrodsky RD.Enzyme immunoassay for the differentiation of antibody response of Brucella abortus infected and vaccinated cattle[J].Am J Vet Res，1989，50（1）：5-9.

[18]Weynants V，Gilson D，Cloeckaert A，et al.Characterization of a monoclonal antibody specific for Brucella smooth lipopolysaccharide and development of a competitive enzymelinked immunosorbent assay to improve the serological diagnosis of brucellosis[J].Clin Diagn Lab Immunol，1996，3（3）：309-314.

[19]Chand PJ，Sadana HV，Batra RN，et al.Comparison of dot enzyme-linked immunosorbent assay（Dot-ELISA）with other serological tests for the detection of brucella antibodies in bovine sera[J].J Vet Med Series B，1989，36（5）：346-352.

[20]王玉玲，柴铭骏，刘红梅.应用荧光偏振检测方法对出口牛进行布氏杆菌病检测[J].中国动物检疫，2012，29（5）：51-52.

[21]朱明东，徐卫民，洪林娣，等.斑点金免疫渗滤法快速诊断布鲁杆菌病的研究[J].中国地方病学杂志，2006，25（3）：326-327.