铁皮石斛与铁皮石斛原球茎质量比较的研究进展

韦丽文辛 宁李培泰时显芸*

（1 广西中医药大学，广西 南宁 530001；2 广西生态工程职业技术学院，广西 柳州 545004）

铁皮石斛与铁皮石斛原球茎质量比较的研究进展

韦丽文1辛 宁1李培泰2时显芸1*

（1 广西中医药大学，广西 南宁 530001；2 广西生态工程职业技术学院，广西 柳州 545004）

铁皮石斛是一种名贵中药材，其药理作用广泛，得到了广泛应用，但其自然繁殖率低，资源形势较为严峻。近年来，研究者们多集中于对铁皮石斛的胚性组织原球茎进行研究，本文通过对比研究铁皮石斛与铁皮石斛原球茎在化学成分、药理作用、石斛多糖成分的提取及测定方法上的差别，以探讨铁皮石斛原球茎成为铁皮石斛新药材资源的可能性。

铁皮石斛；铁皮石斛原球茎；质量比较

铁皮石斛药材为兰科属植物铁皮石斛的干燥茎，具有益胃生津，滋阴清热等功效，用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨萎软等病症。因其种子极小、无胚乳、自然繁殖率极低[1]，被列为国家二级保护植物，而人们不断地开发使用，使得铁皮石斛资源迅速减少，因此，如何持续利用铁皮石斛药材，或开发铁皮石斛的药材新资源，成为近年来众多研究者们的新课题。铁皮石斛原球茎是由铁皮石斛种子通过无菌培养诱导繁殖形成的[2]。它是种子萌发过程中，原胚萌动膨大，突破种皮后形成的浅黄色小圆锥形胚性组织[3]。以铁皮石斛原球茎为材料进行组织培养，通过改变培养基条件，可使铁皮石斛原球茎生长旺盛，繁殖率高，具有较好的开发前景[4]。本文对铁皮石斛与铁皮石斛原球茎化学成分、药理作用、石斛多糖提取及测定方法进行对比研究，探讨铁皮石斛原球茎作为铁皮石斛新药源的可能性。

1 化学成分

1.1 铁皮石斛的化学组成

铁皮石斛的化学组成主要有石斛多糖、生物碱、氨基酸、菲类化合物以及金属元素等。石斛多糖为铁皮石斛的最主要成分，是其发挥药理作用的重要物质基础。吴刚等[5]通过对19种石斛的多糖及生物碱含量进行测定发现，铁皮石斛的多糖含量为19.26%，总生物碱含量为0.359%。蒋秀梅等[6]检测出铁皮石斛鲜品含有6种人体必需氨基酸，1种半必需氨基酸，其中谷氨酸和天门冬氨酸的含量最高。黎万奎等[7]通过实验比较了人工栽培铁皮石斛与其他来源铁皮石斛中氨基酸含量得出人工栽培铁皮石斛与其他不同来源铁皮石斛材料中各种氨基酸组成及含量一致，以天冬氨酸含量最高，其次为谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、丙氨酸等。李榕生等[8]运用各种柱色谱方法进行化学成分分离提纯，从而得到六种化合物，分别鉴定为2，3，4，7-四甲氧基菲、1，5-二羧基-1，2，3，4-四甲氧基菲、2，5-二羟基-3，4-二甲氧基菲、2，7-二羧基-3，4，8-三甲氧基菲、2，5-二羧基-3，4-二甲氧基菲、3，5-二羧基-2，4-二甲氧基菲。其中化合物1，5-二羧基-1，2，3，4-四甲氧基菲、2，5-二羟基-3，4-二甲氧基菲、3，5-二羧基-2，4-二甲氧基菲为首次从石斛属植物中分离得到。诸燕等[9]采用电感耦合等离子质谱法、原子吸收光谱法对11个种质32个样品的铁皮石斛的金属元素进行检测，结果发现铁皮石斛中钾、钙、镁、锰、锌、铬、铜平均质量分数分别为1205.23，766.82，158.25，31.06，4.28，8.28，0.97mg/kg，砷、汞、铅、镉4种重金属元素含量除1个样品镉元素超过限量指标0·07mg/kg外，均在规定限度范围内，种质与生理年龄对金属元素的积累影响显著。

1.2 铁皮石斛原球茎的化学成分

铁皮石斛原球茎是由铁皮石斛组织分化形成，具有与铁皮石斛药材相似的化学组成，但在各成分的含量以及单一成分的组成上仍有一定差别，而铁皮石斛原球茎可通过改变不同培养条件使其中有效成分含量得以提高。在这一问题上陈晓梅等人进行了较为深入的研究，其运用高效液相-质谱分析法对真菌诱导子处理的铁皮石斛原球茎和对照原球茎以及铁皮石斛的指纹图谱进行研究分析得出经诱导子处理的铁皮石斛原球茎没有改变原球茎的化学背景，和铁皮石斛的化学成分相似，而真菌诱导子能促进原球茎中生物碱类成分的产生和特异性积累，石斛多糖是铁皮石斛及其原球茎的共有成分，但在单糖的组成上有所差异[10]。在培养原球茎过程中加入MF24液体发酵菌丝制备的诱导子可提高原球茎的多糖含量[2]。其用相同的提取方法对铁皮石斛药材及其原球茎的多糖成分进行提取，石斛粗多糖主要由Man和Glu组成，而原球茎粗多糖主要由Gal、Ara 和Glu组成[11]。何铁光等[12]通过实验分析得出铁皮石斛野生品及其悬浮培养的原球茎都含有17种氨基酸，前者以谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸和亮氨酸为主要氨基酸，后者以悬浮培养的谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸为主要氨基酸，在人体必需氨基酸中，两者都含有除色氨酸以外的全部人体必需氨基酸，其中，亮氨酸比例最高。孟志霞等[3]从铁皮石斛原球茎中得到8个化合物，分别1-O-p-阿魏酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅰ），arillatoseB（Ⅱ），4-（β-D-吡喃葡萄糖基）苄醇（Ⅲ），4-羟甲基-2，6-二甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅳ），三十六烷酸（Ⅴ），二十七烷醇（Ⅵ），β-谷甾醇（Ⅶ），3β，25-二羟基-23-烯-环菠萝蜜烷（Ⅷ），其中化合物1、2、3、4、8为首次从石斛属中分得。

2 药理作用

2.1 铁皮石斛的药理作用

铁皮石斛中含有的多糖、生物碱、氨基酸等化学成分是其药理作用发挥的重要物质基础，铁皮石斛具有提高人体免疫力、抗氧化以及抗肿瘤等方面的作用，随着研究的不断深入，一些新的药理作用也逐渐被发现。赵水灵等[13]对石斛多糖进行研究发现其能使小鼠的胸腺、脾等部位的重量增加、抗体细胞数明显增多，从而使免疫作用得以增强。鲍素华等[14]通过对铁皮石斛多糖体外抗氧化活性研究，发现铁皮石斛多糖随着浓度的增大其抗氧化的活性也逐渐增强。鲍丽娟[15]对四种石斛的抑瘤作用进行了研究，其中铁皮石斛提取物中的乙酸乙酯部位对人宫颈癌HelaS3的抑制作用相对于石油醚部位、正丁醇部位以及水提物的效果要好，而石油醚部位对于肝癌HepG2的抑制较好，但四个部位的抑瘤作用差别不大。

2.2 铁皮石斛原球茎的药理作用

相似的化学组成，致使铁皮石斛原球茎与铁皮石斛有着相似的药理作用。何铁光等[16]铁皮石斛原球茎进行研究表明其多糖含量与野生铁皮石斛的相当，且能通过提高机体免疫功能和抗氧化能力抑制肿瘤的生长。高建平等[17]比较了铁皮石斛原球茎与原药材的免疫调节作用发现，原球茎能提高机体非特异性免疫功能和细胞免疫功能，并与原药材相比作用强度相似。何铁光等[18]对铁皮石斛原球茎中多糖DCPP1a-1抗肿瘤活性进行研究，发现三个不同剂量的多糖DCPP1a-1对小鼠肝癌H22有不同的抑制效果，其中低剂量组（50mg/k）相对于中剂量组（150mg/kg）及高剂量组（250mg/kg）的抑制作用更为显著，与肿瘤对照相比，多糖低剂量组小鼠的胸腺和脾指数显著增加了，增强了小鼠的机体免疫力。此研究组还对铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a-1对氧自由基和脂质过氧化的影响进行了研究，实验结果表明铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a-1具有较强的抗氧化活性。林宏等[19]利用细胞溶血法测定铁皮石斛原球茎中均一多糖D-02C的CH50值，并与肝素钠的CH50值进行对比研究对比表明D-02C具有较弱的补体活性。

3 石斛多糖的提取及含量测定

3.1 铁皮石斛及铁皮石斛原球茎中多糖成分的提取

石斛多糖是铁皮石斛发挥其药效的重要物质基础，也是其含量较多的一类成分，那么如何高效提取石斛多糖，成为众多学者的课题，铁皮石斛药材中多糖成分的提取方法经历了由传统的水提醇沉法到超声提取、酶提取的发展，使得石斛多糖的提取效率得到大大地提高。钱叶等[20]对粉碎度、提取次数、加水量及提取时间等因素对石斛多糖提取的影响大小进行了正交试验，结果表明影响石斛提取含量的因素依次为粉碎度＞提取次数＞加水量＞提取时间。在水提法的基础上加入超声提取法，可以使石斛多糖的提取率得到提高，即在将石斛粉过筛后对其进行超声水浴提取，通过对比得出当超声功率为300W时，超声频率为45kHz时多糖得率最高[21]。魏明等[22]发现，当超声波功率达到300W时多糖提取量为最大值。当超声波功率过大时，可能因为超声波的剧烈振动使多糖降解，从而使得多糖提取量出现了下降的趋势[23]。尚喜雨[24]对铁皮石斛多糖用水提法、酶法进行了研究，其中水提法的最佳提取条件为：固液比1∶80，水温100℃，浸提时间2h，提取次数2次；联合酶法的最佳提取条件为：酶量（木瓜蛋白酶和纤维素蛋白酶等量混合）4%，水温为40℃，pH值为6，酶解3h。结果水提法的多糖平均提取率为12.07%，酶法的多糖平均提取率为20.84%，说明联合酶法提取铁皮石斛多糖优于单纯水提法。

铁皮石斛药材中石斛多糖的提取方法已经研究得较为透彻，从目前的研究状况观察可知，用于铁皮石斛原球茎多糖的提取方法为水提法，其提取过程与铁皮石斛药材中多糖的水提法过程相似，也有研究者对此方法的影响因素进行了比较优选。何铁光[18]选用热水浸提，并对浸提时间、浸提次数、温度及加水量等4个因素进行正交试验，实验结果表明各因素作用大小关系依次为提取次数＞加水量＞提取温度＞浸提时间，且最佳条件为提取2h，提取次数为3次，温度为80℃，加水量20倍，刘静平等[25]运用正交试验优选铁皮石斛类原球茎多糖的提取纯化工艺相似结论。岑忠等[26]对用热水浸提铁皮石斛原球茎多糖的条件进行了优选，实验结果表明影响最大的因素是浸提次数，其次是浸提时间，料水质量比和浸提温度。且最佳实验条件为浸提次数为4次，浸提3h，料水质量比为1∶60，近体温度为80℃，多糖得率达到9.17%。

4 铁皮石斛药材及其原球茎石斛多糖的含量测定

多糖成分对铁皮石斛的重要性决定了对其进行含量测定并作为铁皮石斛的质量评价标准有着重要的意义，石斛多糖含量测定的方法主要有蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、DNS（3，5-二硝基水杨酸比色法），有观点认为DNS较优于前两种方法。林雅等[27]采用蒽酮-硫酸法测定石斛中的多糖含量，其依据多糖在硫酸的作用下先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后利用与蒽酮的显色反应生成橙黄色化合物，最后以比色法测定其吸光值，进而计算出多糖含量。刘宏源等[28]首次采用DNS（3，5-二硝基水杨酸比色法）法测定铁皮石斛中水溶性多糖的含量，并认为该方法具有重复性好、杂质干扰少、快速、准确灵敏等优点。因DNS在偏碱性条件下与多糖水解产物还原糖共热后被还原生成棕红色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水杨酸）。该化合物在一定的浓度范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。林燕飞等[29]利用3，5-二硝基水杨酸比色法，以葡萄糖为对照测定，研究铁皮石斛不同采收期和不同生长期水溶性多糖的含量变化规律，研究者认为DNS（3，5-二硝基水杨酸）相比较苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法具有明显的优点，因铁皮石斛中的主要药效成分是水溶性多糖而非单糖，苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法二个方法仅能测定总水溶性糖，而DNS法可以通过测定还原糖（或单糖）和总糖，从而计算得到总水溶性多糖。目前，原球茎多糖含量的测定方法则多采用苯酚-硫酸法[30-31]。

5 结 语

通过对铁皮石斛及其原球茎进行质量对比研究发现，两者的化学组成、药理作用都较为相似，均具有提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤活性，两者发挥药理作用的重要物质基础均为石斛多糖，但在多糖的含量以及组成上两者有着一定的差别，铁皮石斛胚性组织原球茎有作为铁皮石斛新药材资源的可能性，因此，铁皮石斛原球茎多糖成分在其生长过程中有着怎样的变化积累过程，以及怎样通过改变培养条件来增加其多糖成分，值得深入研究。其次，铁皮石斛和铁皮石斛原球茎在多糖的提取及测定方法上较为相似，但相对于铁皮石斛多糖较为丰富的提取及测定方法而言，运用于提取及测定铁皮石斛原球茎中石斛多糖的方法却十分单一，那么，原球茎多糖在提取及含量测定方法上能否运用原药材的优选条件仍有探讨价值。

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R282.71

A

1671-8194（2013）25-0059-03

广西铁皮石斛品种资源评价及优良品种繁育技术研究（2013CD）

*通讯作者：E-mail:shxy655@126.com