超声靶向破坏微泡技术在肿瘤治疗中的研究进展

王 龚 卓忠雄

目前，我国对恶性肿瘤的常规治疗方法主要有手术、放疗、化疗和生物靶向治疗等，化疗是肿瘤综合治疗中最常用的手段，其效果主要取决于药物在肿瘤局部的浓度与作用时间，系统化疗时药物进入人体，聚集于肿瘤局部的药物浓度低，维持有效药物浓度时间短，而全身血液循环中药物浓度相对较高，易引起毒副作用[1]。如何在保证最佳抗肿瘤效果的同时避免严重毒副作用的发生一直是临床医学上的热点和难点。

近年来，随着超声造影剂研制工艺的进展和超声影像技术在医学领域的广泛使用，超声靶向破坏微泡（ultrasoundtargeted microbubble destruction, UTMD）技术在肿瘤治疗学领域发展迅速，UTMD技术可以明显降低超声在组织或器官引发空化效应的阈值，空化效应可以辅助多种药物分子、目的基因进入肿瘤组织增强相应的生物学效应[2,3]。本文就UTMD技术在肿瘤治疗领域的应用及相关机制作一综述。

1 UTMD技术的相关机制

UTMD技术是指在特定部位发射不同声强的超声波，当超声强度足够大时血液中的微泡发生破裂，通过产生微射流、冲击波使周围的血管壁或细胞膜表面出现可逆的或不可逆的穿孔，使血管内皮屏障损伤，进而增加血管通透性，增加外源性物质到达特定部位的剂量，从而发挥相应的生物学效应[4,5]。UTMD技术有3个特点：①安全性，超声造影剂是一种高浓度的微气泡混悬液，对人体无毒副作用；②靶向传输的特性，在靶向部位给予一定功率的超声辐照（包括较高机械指数的诊断超声），微泡破裂，释放所携带的药物或基因；③促渗透或转移的作用，微泡破裂产生空化效应，包括声孔效应、微射流等使微血管或细胞的通透性一过性升高，可以促进药物或基因的渗透[6]。

超声联合微泡促进血液中药物或基因转染的机制可能包括：①微泡在较高强度超声的辐照下不断振动、膨胀、收缩，发生破裂，由此产生的微射流和冲击波在细胞膜上形成可逆的非致死性小孔，使基因或药物通过小孔进入细胞，这种超声的空化效应和声孔效应理论是超声联合微泡促进基因转染的主要机制；②超声辐照微泡造影剂后产生的活性氧（H2O2）使Ca2+内流，细胞膜通透性增加，且不影响细胞活性；③超声联合微泡辐照肿瘤组织区域产生热效应，细胞膜吸收和分散超声能量，局部温度短暂升高，影响磷脂双层流动性和细胞膜通透性[5,7]。

2 UTMD技术在肿瘤治疗中的应用

2.1 UTMD技术栓塞肿瘤微血管 肿瘤组织具有诱导新血管生成的能力，新血管不仅可以为肿瘤细胞提供氧气、营养物质，还可以不断地向宿主其他部位输送肿瘤细胞，从而使恶性肿瘤生长和转移[8]。抗肿瘤血管生成是继手术、化疗和放疗等之后的一种新型肿瘤治疗方法。介入治疗主要针对管径较大的肿瘤营养血管，对小的滋养血管不能有效栓塞，而且对于多发、散在的肿瘤组织也难以手术或血管栓塞治疗，现有方法多通过药物攻击肿瘤新生血管的特异性靶点，抑制血管增生，不良反应较多，治疗效果不甚理想[9]。

肿瘤组织中的新生血管与正常组织成熟血管比较，在结构和功能上均有明显差异。①包绕肿瘤血管的基底膜明显减少，肿瘤血管通透性明显升高；②肿瘤血管内皮细胞分化程度较差，缺乏成熟的内皮细胞；③肿瘤血管内皮细胞多处于细胞增殖期，更新速度是正常成熟血管内皮细胞的20倍；④肿瘤组织血管壁缺乏神经和肌肉成分，不能对血管活性物质产生相应的影响[10,11]。

UTMD技术可以直接作用于供应肿瘤组织的营养血管网，通过破损癌组织的微血管壁，激活内源或外源性凝血机制，诱发大面积肿瘤组织新生血管的血栓形成，从而切断作用区域内肿瘤血液的供应途径，使肿瘤坏死[12]。为了增加栓塞血管效果，可以将凝血酶原类、抗血管生成类药物与微泡进行融合，或将其整合入微泡，使其在靶组织内释放，进而达到更好的栓塞效果。近年来利用此技术诱导微血管栓塞治疗实体肿瘤的研究越来越多，为肿瘤治疗提供了新的治疗思路[13]。

吴巍等[14]使用频率为20 kHz、输出功率为0.5 W的超声治疗仪联合自制的CO2微泡对实体肿瘤进行辐照，发现其对肿瘤组织微血管具有较好的栓塞效果。钟渝等[15]使用自制的新型超声空化治疗仪联合注射剂量为0.2 ml/kg的脂氟显微泡辐照大鼠皮下移植瘤3 min，发现新型超声空化治疗技术能够毁损大鼠Walker-256肿瘤的微血管、阻断其微循环，可能成为一种新型的物理抗肿瘤血管生成方法。王宇等[16]使用频率为20 kHz，辐照强度为200 mW/cm2的超声联合0.2 ml微泡造影剂有效抑制了前列腺癌移植瘤的生长，电子显微镜下超声微泡组肿瘤内微血管内皮细胞损伤，线粒体肿大，基底膜断裂；同时其内的CD34阳性染色微血管数减少，提示其抑瘤机制可能是通过超声空化效应破坏肿瘤的微血管实现的。此外，超声微泡造影剂可以使其所携带的血管生成调节因子在靶组织中定向释放，更好地控制肿瘤血管的生长。Emoto等[17]利用UTMD技术使微泡携带血管生成抑制剂烟曲霉素的衍生物，对肿瘤血管内皮细胞进行靶向释放，增强了抑制肿瘤血管化的效果。康娟等[18]使用超声靶向破坏载有紫杉醇的微泡，发现肿瘤组织血管密度、CD34、血管内皮生长因子的表达水平均明显降低，其抗肿瘤效果明显增强。Duvshani-Eshet等[19]利用UTMD技术将血管内皮生长因子抑制剂注入前列腺癌细胞内辐照20 min，明显抑制了癌细胞的扩增并诱导了其凋亡。

2.2 UTMD技术提高肿瘤细胞内化疗药物治疗效果 临床肿瘤化疗时常规给药途径主要包括口服和静脉注射，血液中的药物需克服血管内皮屏障，穿过肿瘤组织间隙和肿瘤细胞膜进入肿瘤细胞才能发挥相应的抗癌效果。为使化疗药物在肿瘤靶区达到有效浓度必须增大给药剂量，这可能破坏正常组织和细胞，进而造成全身毒副作用，同时基因或肽类等大分子物质较难进入细胞内发挥相应的治疗效果[20]。UTMD技术可以通过增加血管及细胞膜通透性，辅助多种治疗药物进入细胞，提高细胞内的药物浓度，减少用药剂量及毒副作用。

微泡造影剂是一种新型载体，UTMD技术可以使其携带的药物定位释放，达到靶向治疗的目的。目前已知微泡与药物的结合的方式有：①静电吸附在微泡外壳，但其在血液循环中极不稳定，药物容易脱落；②包裹进入微泡内，这种药物结合方式相对比较稳定，且载药率和包封率相对较高；③以非共价方式与微泡外壳相结合，如生物素-亲和素系统等。药物体内定位释放技术不仅可以显著降低药物用量，减轻药物的毒副作用，而且可以提高病灶区域的药物浓度，延缓药物释放、减少给药次数，从而增强治疗效果[21-23]。

Li等[24]使用UTMD技术破坏携带羟基喜树碱的超声微泡，对实验组小鼠皮下肿瘤进行靶向辐照，与对照组相比，实验组明显观察到药物在肿瘤部位聚集；实验组和对照组对肿瘤组织的抑制率分别为70.6%和47.8%。董虹美等[25]使用低频超声联合微泡对米托蒽醌作用于MCF27乳腺癌细胞作用进行观察，透射电镜下可见细胞凋亡明显，细胞膜通透性增加，药物进入细胞内部明显增加。Kang等[26]发现UTMD技术联合载多西紫杉醇脂质微泡能够明显抑制兔VX2皮下移植肝癌微血管的生成，进而对肿瘤生长产生明显的抑制作用，实验组兔存活时间较对照组延长。Aryal等[27]使用聚焦超声联合多柔比星脂质体微泡对大鼠胶质瘤进行靶向辐照，发现其能够打开血-肿瘤屏障和血-脑屏障，提高局部肿瘤组织药物浓度，减轻毒副作用。Zhao等[28]观察超声定位辐照脂质微泡联合阿霉素对裸鼠白血病移植瘤的抑制效应，发现超声定位辐照脂质微泡可以有效地增强阿霉素的疗效，具有较强的体内抑瘤效果。Sorace等[29]将Def i nity微泡及紫杉醇经鼠尾静脉注射裸鼠体内后，给予超声辐照乳腺癌移植瘤体，发现超声辐照联合微泡可以增强化疗药物的药理作用，抑制瘤体生长。Xing等[30]使用卵巢癌SKOV3细胞悬液建立裸鼠皮下移植瘤模型，发现超声靶向破坏载紫杉醇微泡对肿瘤组织进行辐照，能够显著下调肿瘤血管内皮生长因子及抑癌基因的表达水平。

2.3 UTMD技术增加治疗基因的抑瘤效果 肿瘤组织的基因治疗是指运用分子生物学技术把正常基因或重组治疗基因导入异常肿瘤细胞，以抑制致病基因表达或修复缺陷基因表达，使基因表达产物起到治疗作用。治疗基因要成功转导需依次克服3个障碍：细胞外传输、细胞摄取和细胞内传输。病毒载体通过与细胞表面特异性受体结合，可以逃避细胞内溶酶体降解，克服细胞摄取和细胞内传输2个障碍，基因转染效率高，但由于病毒的免疫原性和致突变性，使其安全性低、可控性差；相反，非病毒载体（如脂质体）安全、可控，但不能有效地克服上述3个障碍，基因转染率较低。此外，病毒及非病毒载体均不能很好解决靶向传输问题，常规局部注射或灌注等方法，不仅有创，存在操作风险，而且不能实现均匀转染[31,32]。

UTMD技术介导基因转染是近年来发展起来的有效方法[3]，超声微泡作为一种靶向治疗载体，破坏后释放的基因能够进入细胞内、血管壁，甚至组织间隙，增强基因的转染表达，从而发挥靶向性治疗作用[33]。Li等[34]发现超声联合微泡技术对自杀基因KDRP-CD/TK治疗乳腺癌细胞具有明显的促进作用。Zhou等[35]采用UTMD技术将单纯疱疹病毒胸腺激酶（HSV-TK）自杀基因与脂质微泡混合制成载HSV-TK基因微泡，注入肝癌模型小鼠体内，结果发现，与对照组相比实验组小鼠体内TK蛋白表达显著增加，肿瘤抑制效应显著，小鼠存活时间显著延长，证明超声靶向微泡破坏可以有效转染HSV-TK基因进入靶组织，抑制肿瘤生长。Duvshani-Eshet等[36]应用超声联合微泡介导pPEX基因靶向作用前列腺癌组织，结果发现单纯应用超声辐照转染pPEX基因的前列腺癌细胞生长受抑制率为35%，超声联合微泡介导pPEX基因的前列腺癌细胞抑制率为50%，而重复应用超声联合微泡介导pPEX基因的前列腺癌细胞抑制率为80%，同时未对周围组织造成损伤，这说明超声联合微泡是一种新型非病毒转染的、安全有效的基因治疗方法。

3 UTMD技术的问题与展望

UTMD具有无创、安全、高效等优点，能够明显增加肿瘤的治疗效果。但目前相关研究基本停留在细胞和小型动物实验阶段，尚缺乏应用于大型动物模型的相关报道，此项技术进入临床应用前仍存在很多问题有待深入研究：①肿瘤的发生、发展过程复杂，机制尚不明确。目前广泛应用的异种基因移植模型个体之间存在差异和变异，不同肿瘤细胞对药物的敏感度也各不相同，微泡荷载的不同化疗药物或基因是否对所有肿瘤均有效果尚待确认[37]；②超声仪器设备、参数、作用方式、药物与微泡的结合方式及实验对象均不相同，这些均会影响药物的传输效率，对相关参数进行优化尚未形成共识；③微泡载药量较低，在循环系统中的稳定性差，需要改进微泡的化学组成制作工艺及其携带药物方式；④超声破坏微泡可能对周围组织造成一定的损伤，要将这一技术应用于临床，还要对微泡剂量、浓度和超声辐照参数进行优化，使其尽量与诊断超声的条件相一致，提高对人体的安全性。尽管当前的研究存在诸多难题，但随着超声技术和分子生物学在医学领域的发展，以及微泡造影剂的研制进展，超声联合微泡技术在肿瘤治疗中必将具有极为广阔的应用前景。

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