中药谱效关系研究进展

2013-01-24谭振鹏夏英杰王柳萍

中国民族民间医药 2013年2期

谭振鹏夏英杰王柳萍辛宁

广西中医药大学，广西南宁 530001

自从2000年8月国家药品监督管理局颁布《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行)》之来，中药指纹图谱的研究工作已成为业内的一个热点，用于中药材及中成药的质量标准制定。指纹图谱具有整体、宏观和模糊分析的特点，特别适合于中医药传统理论的研究需要，是目前能够被国内外广泛接受的一种中药质量评价模式［1］。但其同样存在一定的局限性，与药理作用相关性并不明确，无法从指纹图谱中解析某一峰或者某一段峰所代表的药理作用。因此，李戎等［2］提出在对方剂物质群整体进行控制的中药指纹图谱基础上对应药效结果，建立起有实际意义的中药“谱效”学，才能建立中药产品与其疗效基本一致的反映产品内在质量的质量标准。目前，对于如何进行谱效关系的研究尚无统一认可的模式，本文主要对近年来众学者在此方面进行的研究文献做简单的归纳、总结，为中药谱效关系的进一步研究做参考。

1 构建谱效关系的基础

1.1 指纹图谱中药指纹图谱是借用法医学中的指纹图谱这一概念，将中药材或中成药经过适当的处理之后，运用现代信息采集技术及质量分析手段，获得所测样品的图谱及数据信息，在对中药成分系统研究的基础上，构建中药指纹图谱［3］。目前获得中药指纹图谱的方法主要有光谱法和色谱法，比较常用的分析方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱、红外光谱、色质联用技术、毛细管电泳技术、分子生物学技术等。目前，关于谱效关系研究的文献中，使用的指纹图谱主要集中在高效液相色谱法，气相色谱法和色质联用技术等方面。

1.1.1 高效液相色谱法高效液相色谱法 (HPLC)有高效能、高准确度、快速检测等优点，配备不同的检测器后，能满足对不同性质的样品的测定，且稳定性和重现性都较好。目前已有相当数目文献报道使用HPLC对中药材和中成药进行指纹图谱分析研究，其应用范围十分广泛［4］。宁黎丽等［5］在吴茱萸汤原方基础上按正交试验法组成9个不同配比的处方，对其进行HPLC分析，并与以镇痛和止呕为指标的药理实验相关联，确定吴茱萸汤的药效物质基础。李友等［6］采用HPLC色谱峰获得板蓝根三氯甲烷部位的指纹图谱，用于分析板蓝根三氯甲烷提取部位抗内毒素作用的谱效关系。林珊等［7］对太子参有效部位进行HPLC指纹图谱分析，并采用MTT法研究提取物对不同来源的肿瘤细胞株的作用。

1.1.2 气相色谱法气相色谱法主要用来分析中药材或中成药中的挥发性成分，具有良好的分离效能和分离速度，封闭的色谱系统使其拥有较好的稳定性，特别适用于含有挥发性成分的药材和制剂指纹图谱的研究［8］。尹莲等［9］对加味四妙丸不同工艺全方及不同组合有效部位进行药效学实验，测定其GC指纹图谱，通过数理统计方法将指纹图谱共有峰相对面积与药理数据二者关联起来，比较GC指纹图谱的有效共有峰的变化特征，得出其挥发油指纹图谱中与药效相关的色谱峰及挥发油成分在全方和有效部位群配伍组合后共有峰数量和峰面积的变化。研究表明指纹图谱谱效关系是表征复方整体成分－配伍－药效的相关性的有效途径。

1.1.3 色质联用技术色质联用技术是指将色谱仪器与质谱联合使用的一种技术，在对物质进行分离的基础上，通过质谱提供各指纹峰更多的信息，方便对指纹峰成分的鉴定。主要包括气质联用 (GC－MS)和液质联用 (HPLCMS)。卢红梅等［10］在对鱼腥草注射液质量控制的研究中采用GC－MS对不同厂家的注射液进行分析，对有显著药效的第1类注射剂指纹图谱进一步定性分析，确定有效指纹峰族的主要成分。沈岚等［11］采用HPLC－ESI－MS/MS分析芍药甘草效应组分给药后的血清样品，发现与药效相关比较大的四个色谱峰的物质为效应组分代谢成分，直接获得体内活性物质。宋玉超等［12］以川赤芍、赤芍、白芍不同提取物LC－MS图谱峰面积为基础，对 LC－MS图谱和抑制细胞增殖的内在联系进行谱效分析。

1.2 药效学数据药效学数据可通过进行科学合理的药理学实验获得。目前中药药理学实验研究方法大致分为在体实验和离体实验。在体实验为了保持机体的完整性，通常使用正常或人工复制成疾病模型的动物，并使机体与外界环境保持了正常联系;离体实验则采用离体脏器，单一的考察药物对机体某一部分的作用，较为直观，细致的体外分析对于在细胞和亚细胞水平上进行的机理研究有着重要的意义［13］。体外实验可以严格控制实验条件，所以具有重复性好，用药量小、节省动物，实验结果较易分析等特点;而在体实验保持了机体的完整性，适用于神经反射、体液调节、内脏功能、机体对药物的代谢排泄等的观察，而且可以选择不同给药途径，更符合临床实际［14］。贺福元等［15］认为在中药药理学实验设计过程中应在机体药物浓度为零时再进行实验后的效应指标观察，比较药物在机体血药浓度均为零时的效应指标变化，分清效应指标的变化究竟是药物产生的作用还是仅仅由于机体的应激反应造成。按照其实验设计的方法主要是研究效应体对生物体的动态作用，回答生物现象过程中的状态函数的量变问题，故建议首选在体实验。

对于构建谱效关系的药理实验应当根据研究课题的主要指导思想，建立符合中医基础理论的动物模型，选取准确、快速、公认的方法和指标来进行实验。赵艳玲等［16］采用平板法测定不同来源板蓝根正丁醇部位对大肠杆菌及金葡球菌的半数抑菌浓度，以此来作为衡量板蓝根正丁醇部位的抑菌效果。王娅等［17］以角叉菜胶致大鼠足跖肿胀模型研究白虎汤及各配伍组的抗炎作用，测算肿胀抑制率作为指标。李友等［6］用动态浊度法检测不同产地板蓝根三氯甲烷萃取物抗内毒素生物活性，得到板蓝根对内毒素抑制的量效关系曲线及其参数斜率(k)、半数有效剂量(IC50)。

2 构建谱效关系的数据处理方法

指纹图谱的测定和药理学实验的方法都处于比较成熟的阶段，而如何将“谱”和“效”合理、科学的联系起来还处在探索阶段，没有统一的可以遵循的模式，但根据文献报道主要有以下几种方法。

2.1 灰色关联度分析关联度是事物之间、因素之间关联性大小的度量。它定量的描述了事物或因素之间相互变化的情况，即变化的大小、方向与速度等的相关性。如果事物或因素发展的态势基本一致，则可以认为它们之间的关联度较大，反之，关联度较小。与其他的分析方法相比较，灰色关联度分析所要求的数据较少，对数据的要求较低，原理简单，易于掌握和理解［18］。陈华国等［19］采用灰色关联度分析虎杖不同极性提取物的HPLC指纹图谱与其抗炎、抗肿瘤活性的相关性，研究证明二者有一定的相关性。朱诗塔等［20］用HPLC法研究掌叶大黄不同炮制品水提物指纹图谱，用小鼠剪尾尖法研究其止血作用，用灰色关联度分析方法研究其谱效关系。孟庆刚等［21］用灰色关联统计方法将HPLC图谱的各组分峰的峰面积和解热药效数据相关联，研究谱效相关性，找出黄芩解热作用的物质基础。

2.2 聚类分析聚类分析又称群分析，是根据“物以类聚”的道理，对样品或指标进行分类的一种多元统计分析方法，他们讨论的对象是大量的样品或数据，要求能合理按各自的特性来进行合理的分类，没有任何模式可供参考或依循，即是在没有先验知识的情况下进行的［22］。卢红梅等［10］对各厂家的鱼腥草注射剂指纹图谱采用基于欧式距离和均连法的层级聚类分析方法进行聚类，将六种不同厂家的产品分成两类，再与药效结果差异进行比较，得出一类能够体现抗炎药效的鱼腥草注射液指纹图谱。赵艳玲等［16］为了研究中药板蓝根的正丁醇提取部位的化学指纹图谱和抑菌活性，以系统聚类分析方法研究了不同来源样品的化学成分差异性，结合抑菌活性做相关分析，发现板蓝根正丁醇部位的抑菌活性有效成分。

2.3 相关分析在中药谱效关系学研究中，相关分析主要是指指纹图谱中的“峰”与药效学中的“效”之间的相互关系，由于谱效关系的复杂性，这种相互关系一般是非严格的、不确定的数量依存关系，称之为相关关系，而相关分析的目的之一就是从这种不严格的关系中判断其关系的密切程度［31］。沈岚等［11］利用SPSS的双变量相关分析方法处理所得各来源芍药甘草的特征色谱峰与药效抑制率的相关系数，结果发现芍药甘草效应组分给药后体内4个色谱峰与药效相关性较大，呈正相关。林立等［24］泻白散中各药进行正交组合，测定HPLC指纹图谱及评价祛痰、抗炎作用，采用双变量相关分析法处理所得数据，得知桑白皮中有两个峰显示与祛痰抗炎作用有呈正相关，初步判断为二苯乙烯苷类成分。黄勇等［25］用SPSS的双变量相关分析法，分析来源于灯盏细辛提取物不同配伍组样品的12个特征色谱峰与生物活性指标的相关性。发现灯盏细辛在指纹图谱中的B、C组分段具有明显活性;其中4、7～12号色谱峰与活性呈现正相关。

2.4 回归分析回归分析是研究一个或多个自变量与一个因变量之间，是否存在某种线性或是非线性的关系的一种分析方法。中药谱效关系研究中多运用多元线性回归法，主要有强迫引入法、逐步回归法、强迫剔除法、后向逐步法、前向逐步法。钱俊等［26］将加位四妙丸中各有效部位及各组方药中的有效部位进行正交组合，测定指纹图谱及评价抗炎、镇痛及降尿酸作用，用SPSS统计软件多元线性回归分析中的强迫引入法和逐步回归法处理所得数据，得出有效部位群中12个共有峰均与抗炎、镇痛、将尿酸作用相关，并进一步得出结果不同共有峰与不同药效结果的相关性。许良等［27］对蒙药森登－4汤进行正交设计，拆方森登－4汤，将所得的16个组方一一做抗炎镇痛药理实验和反相高效液相进行色谱分析，采用多元线性回归法分析以上化学数据和生物数据，在32个色谱峰中有15个与药理数据密切相关的色谱峰被引入回归方程，说明原方至少有15中成分在协同作用，成为抗炎镇痛主要药效的物质基础

3 谱效关系研究思路

目前中药谱效关系学主要应用于单味药材的质量评价和中药复方的药效物质基础这两方面。其根本的思路都是建立指纹图谱，进行药效学实验，然后通过数学软件和计算机技术将二者联系起来，即将“谱”与“效”联系起来，建立更加合理全面的、符合中医中药理论体系的质量评价体系。

3.1 单味中药材研究对于单味中药材，可以根据研究目的的不同，选取不同产地、不同品种、不同提取部位或是不同炮制方法的样品建立指纹图谱和进行药效学实验，从而分析中药材中哪些成分与药效显著相关，为进一步建立评价药材质量的指纹图谱进行指导。如赵艳玲等［16］选取10个不同来源的板蓝根药材进行实验，分析了不用来源的样品的化学成分的差异，结合抑菌活性做相关分析，发现板蓝根正丁醇部位的抑菌活性有效成分。陈华国等［19］以虎杖不同提取部位的提取物为研究对象，进行HPLC分析和抗菌、抗肿瘤实验。孟庆刚等［21］将黄芩提取物给予通过干酵母造大鼠发热模型。将HPLC图谱的各组分峰的峰面积和解热药效数据相关联，研究谱效相关性，找出黄芩解热作用的物质基础。

3.2 中药复方研究中药复方成分比单味药材更加复杂，为研究其药效物质基础，通常将原方进行拆方。用于拆方的思路和方法主要有单味药研究法、撇药分析法、分组研究法、据有效部位或成分的分组研究法和应用数理原理指导拆方研究等［28］。实际应用中，应该根据实际需要，对不同拆方方法所得组别进行指纹图谱和药效数据的采集，进行谱效关系的分析。如宁黎丽等［5］通过对吴茱萸汤进行组方药量变化，在原方基础上按正交试验法组成9个不同配比的处方。王娅等［17］对白虎汤及各配伍组共15个样品进行实验。钱俊等［26］将加位四妙丸中各有效部位及各组方药中的有效部位进行正交组合，得出8个样品进行试验。

4 总结

由于中医药理论与现代医学的差异，中药是我国传统医学的宝贵遗产，具有鲜明的民族特色，无论是它的指导思想还是它的用药组成，都与西方药物体系有着很大的区别。这也决定了现代中药的研究，没有一个现成的模版可以借鉴，必须走学科交叉与创新的道路［29］。中药谱效关系将中药指纹图谱与中药药理学通过数理统计方法结合起来，走了一个多学科交叉的路线，目前尚处于起步阶段，有许多问题需要解决。例如，相对于指纹图谱构建的众多方法，用于谱效关系研究的指纹图谱相对单一，如何将更多的指纹图谱分析技术用于谱效关系研究也成为一个问题。同时，李云飞等［30］提出将中药多维指纹图谱用于谱效关系研究也提供了一个新的思路;药效学有效性的表述上大多采用的西医的计量标准，而未与中医理论相结合;建立一个科学合理的数据处理方法系统，使其更加准确的表达谱与效之间的关系。

中药化学成分的多样性与复杂性是发挥其疗效的物质基础，同时也是质量评价的重点与难点，在现有研究手段和条件下，由于中医药理论与现代医学的差异，使得阐明中药的有效成分是一项极为困难的研究课题。进一步完善中药谱效关系的研究有助于建立一种合理、有效的中药内在品质的研究和评价方法，并填补中药质量控制指标与药效研究相脱节的空白，这对中药的现代化和国际化有着重要的意义。总之，中药谱效关系的研究将成为今后中药研究的一个重点方向和有利手段，同样也是一个研究难点，需要在不断实践中探索而完善。

［1］罗安国，王义明，曹进，等.建立我国现代中药质量标准体系的研究［J］.世界科学技术－中药现代化志志，2002，4(4):5－11.

［2］李戎，闫智勇，李文军，等.创建中药谱效关系学［J］.中医教育ECM，2002，2(21):62.

［3］石志红，何建涛，常文保.中药指纹图谱技术［J］.大学化学，2004，19(1):33－39.

［4］孙波，孙涛.高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析［J］.时珍国医国药，2006，17(1):109－110.

［5］宁黎丽，毕开顺，王瑞，等.吴茱英汤药效物质基础的方法学研究［J］.药学学报，2000，35(2):131－134.

［6］李友，马莉，沈芃，等.板蓝根三氯甲烷提取部位抗内毒素作用的“谱效”关系研究［J］.中国药学杂志，2011，46(10):741－744.

［7］林珊，蔡巧燕，曾建伟，等.太子参细胞毒活性部位HPLC谱效关系分析［J］.天然产物研究与开发，2012，24:349－352.

［8］单义旻，辛宁.中药指纹图谱的研究进展［J］.中国中医药信息杂志，2006，13(8):85－88.

［9］尹莲，钱俊.加妙四位丸有效部位群GC指纹图谱谱效关系及配伍变化研究［J］.中成药，2007，29(5):634－637.

［10］卢红梅，梁逸曾，钱频.鱼腥草注射液质量控制中的谱效学初步探讨［J］.药学报，2005，40(12):1147－1150.

［11］沈岚，张梁，冯怡，等.芍药甘草复方效应组分谱效关系研究［J］.中国中药杂志，2008，33(22):2658.

［12］宋玉超，马海波，张旗，等.赤芍、白芍的LC－MS色谱峰与细胞抑制率的谱效关系研究［J］.现代药物与临床，2012，27(2):103－106.