肿瘤多药耐药机制及其相关信号通路的研究进展

邢风娟，王 岩，孟令杰

（吉林大学中日联谊医院 临床基因诊疗中心，吉林 长春 130033）

肿瘤多药耐药机制及其相关信号通路的研究进展

邢风娟，王 岩＊，孟令杰

（吉林大学中日联谊医院 临床基因诊疗中心，吉林 长春 130033）

＊通讯作者

临床肿瘤治疗中化疗药物的应用在一定程度上抑制了肿瘤的生长，复发和转移，但近年来，肿瘤多药耐药的产生严重影响了化疗对肿瘤的疗效。多药耐药（multidrug resistance，MDR）由一种抗肿瘤药物诱发，同时产生对多种结构和作用机制不同的药物敏感性减弱，导致化疗失败。MDR产生机制主要包括以下方面。

1 肿瘤耐药的主要分子生物学机制

1.1 ABC盒式转运蛋白的高表达 主要有P－糖蛋白（P－glycoprotein），多药耐药相关蛋白（multi－drug resistance related protein，MRP），肺耐药相关蛋白（lung resistance－related protein，LRP）和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等。P－gp是一种由多药耐药基因 MDR1编码的，分子量170KD的跨膜转运蛋白，具有ATP酶活性，能将多种化疗药物从胞内泵出胞外，从而降低胞内的有效药物浓度致多药耐药的产生［1］。MRP与P－gp同属于ATP盒式转运蛋白家族。MRP是谷胱甘肽、葡萄糖醛酯、硫酸盐化合物的主要转运者，也是抗肿瘤药物主要转运者。MRP1存在于多种肿瘤细胞中，与细胞的耐药相关。BCRP也是ATP盒式转运蛋白家族成员之一，是一种膜蛋白，在胎盘、肝脏、血脑屏障等分布广泛，也是参与多药耐药的主要成员之一［2］。LRP不属于ABC家族，它能阻止化疗药物进入细胞核，也能通过胞吐作用将胞内的药物排出。

1.2 酶介导的MDR 主要有谷胱甘肽－S转移酶（Glutathione S－transerases，GST），DNA拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）和蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）等。GST与细胞的解毒功能相关，其催化谷胱甘肽与化疗药物相结合，使药物代谢为无毒性物质。其次，谷胱甘肽与化疗药物相结合形成GSH－药物结合物（GSH－X），然后被多药耐药相关蛋白泵出细胞外，降低胞内药物浓度。DNA拓扑酶能催化超螺旋DNA的解旋反应，参与DNA复制、转录。TopoⅡ能与蒽环类抗生素结合，切断DNA导致细胞凋亡。TopoⅡ活性、含量的下降或者基因突变都将导致细胞耐药的产生［3］。PKC可以增加P－gp的磷酸化水平，使细胞内药物聚集浓度减少，从而增加耐药性。

1.3 控制凋亡的基因和蛋白的改变 肿瘤细胞抗凋亡是MDR的重要机制之一，多数化疗药物是通过细胞凋亡导致细胞死亡。抗凋亡基因的过度表达或凋亡基因缺失都将导致MDR产生。野生型P53基因可以抑制多种癌基因，并参与DNA损伤修复。突变型P53基因使肿瘤细胞逃逸放化疗所致DNA损伤诱导的细胞凋亡，产生耐药。Bcl－2是一种抗凋亡基因，其过度表达时将抑制细胞凋亡，使肿瘤细胞重新生长。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中最小的成员，在多种肿瘤细胞中过表达，参与肿瘤细胞的发生、发展、化疗耐药。将Survivin沉默后，肺腺癌和软骨肉瘤细胞G2／M期阻滞，且对化疗药物敏感性增强，原因与化疗药物作用于细胞后Caspase3／7活性增强促进了细胞的凋亡有关［4，5］。

2 肿瘤多药耐药的相关信号通路

2.1 PTEN／PI3K／AKT信号转导途径

PI3K／AKT是促进细胞增殖，抑制凋亡的一条经典信号通路。近年来研究发现，其在肿瘤的发生发展中也起了主要的作用，如参与血管发生，化疗耐药和放疗抗拒等。磷脂酰肌醇－3激酶 （phosphatidylinositol－3－kinase，PI3K）为 一 种胞质蛋白，具有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶和磷脂酰肌醇激酶双重活性。当细胞受各种生长因子等刺激后，PI3K的激活将导致3，4－二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）转化为3，4，5－三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）［6］。PIP3可与胞内 AKT结合，进而激活AKT。AKT是原癌基因c－AKT编码的一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，有三个结构区分别为PH区，激酶／催化区，调节区。PIP3与AKT的PH结构域结合并介导AKT由胞质转移到胞膜。激活后的磷酸化AKT蛋白再到胞浆中或者胞核内，将磷酸化下游靶蛋白，最终产生一系列生物学反应。

2.2 PI3K／AKT信号通路的调控网络

PI3K／AKT信号转导通路受多因子调节，参与调节的分子主要是负反馈分子，包括PTEN、CTMP（carboxyl terminal modulator protein ）、PHLPP（PH domain leucinerich repeat protein phosphatase）和SHP2（Src homology phosphotyrosyl phosphatase 2）等抑癌蛋白［7］。PTEN是一种具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，其编码的蛋白能使PIP3去磷酸化，阻断PI3K／AKT信号通路，从而促进细胞凋亡、抑制细胞增殖、抑制肿瘤新生血管生成，抑制肿瘤迁移和侵袭、逆转细胞耐药等作用。

NF－KB蛋白家族是一种多效性转录因子，可以与启动子部位的KB位点发生特异性结合从而促进其转录表达。最基本的NF－KB信号通路，包括IKB激酶复合物，IKB蛋白和NF－KB二聚体。当细胞受到刺激后，IKB激酶被激活，从而导致IKB蛋白降解，NF－KB得以释放，并转移至细胞核中与目的基因结合，促进目的基因转录。激活的PI3K／AKT能够导致IKB激酶磷酸化，激活NF－KB进而改变基因的表达来促进肿瘤细胞生长，抑制凋亡，促进迁移。mTOR，雷帕霉素作用的靶分子，是一种丝氨酸／苏氨酸激酶。mTOR是PI3K／AKT信号通路主要的下游分子。AKT可激活mTOR，激活的mTOR可调控多种基因的翻译，如cyclinD、CDK4、c－myc等，进而调控肿瘤细胞的生长增殖，细胞周期，迁移等［8］。

2.3 PTEN／PI3K／AKT在肿瘤多药耐药中的研究进展

PTEN／PI3K／AKT信号通路介导与 p－gp，MRP1介导的多药耐药存在密切联系。Lee等研究发现人前列腺癌PTEN基因缺失的细胞系AKT及P－Akt的表达均高于PTEN阳性表达的细胞，且前者对阿霉素和紫杉醇有较高的耐药性。PI3K活化可增加CaP（人前列腺癌细胞系）内MRP1基因及蛋白的表达水平，致细胞耐药性增强，而LY294002（PI3K抑制剂）能增强CaP对阿霉素和紫杉醇的敏感性［9］。杨玉捷等通过体外诱导法成功建立人结肠癌的顺铂耐药细胞系，LY294002阻断PI3K／AKT信号通路后，耐药细胞株中的P－AKT蛋白水平显著降低，且细胞的生长抑制率和凋亡率均明显升高［10］，提示细胞耐药的产生与PI3K／AKT的激活抑制了肿瘤细胞的凋亡有关。PI3K／AKT信号通路激活后可上调mTOR表达，进而促进细胞的增殖，抑制凋亡，导致细胞的多药耐药。人肺腺癌耐顺铂细胞株A549／CDDP与A549细胞比，AKT1的基因和蛋白表达水平增多，且耐顺铂机制与PI3K／AKT／mTOR信号通路激活有关，经LY294002或雷帕霉素（mTOR抑制剂）处理后，明显地抑制了耐药细胞的增殖［11］。Wortmannin（PI3K抑制剂）处理白血病耐药细胞后，耐药细胞MRP1表达下调，胞内Rhodamine123蓄积减少，可能与PI3K／AKT信号通路被抑制而导致的P53蛋白增多有关。P53可抑制MRP1启动子活性，，降低胞内MRP1表达。而耐药细胞中p－gp与上述信号通路无关［12］。报道证实，PI3K／AKT的下游作用因子NF－KB可以激活MDR1基因的转录。抑制NF－KB可以降低人结肠癌HCT15细胞 MDR1mRNA和p－gp的表达。雷公藤内酯（TPL）作为NF－KB的抑制剂与阿霉素联合应用可以明显增强K562／A02对阿霉素的药物敏感性。TPL可以明显抑制p－gp的表达，致胞内抗肿瘤药物浓度增加［13］。

LY294002可明显抑制PI3K／AKT信号通路，改善耐药细胞对抗肿瘤药物的敏感性，提高化疗疗效。LY294002预处理胃癌耐药细胞SGC7901／ADR和白血病耐药细胞K562／DNR可部分抑制p－AKT和P－gp的表达，增强药物敏感性，随着处理时间的延长，胞内药物蓄积有增强的趋势［14］。石小燕等用LY294002处理卵巢癌耐药细胞A2780／Taxol细胞后，流式细胞仪检测细胞凋亡率明显升高；A2780／Taxol细胞对紫杉醇敏感性增加，相对逆转率达78%；MDR1mRNA、P－Akt及 P－gp蛋白均明显降低［15］，提示可把阻断PI3K信号通路作为分子靶向治疗的方向，研究相应小分子抑制剂，逆转MDR。

3 MAPK信号转导途径

3.1 MAPK信号通路

MAPK，丝裂原活化蛋白激酶，是哺乳动物内广泛存在的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。MAPK信号转导通路主要分为4类，分别为：细胞外信号调节激酶（ERK1／ERK2），c－Jun氨基末端激酶（JNK1，2，3／SAPK），p38丝裂原活化蛋白激酶 （p38MAPKαβγ），ERK5／大 丝 裂 素 活 化 蛋 白 激 酶（ERK5／BMK1）［16］。不同的信号刺激可以激活不同的通路。ERK1／2信号通路主要是在生长因子，有丝分裂原、G蛋白耦联受体等刺激时连续激活Raf，MEK1／2，ERK1／2促进细胞增殖、分化。JNK有三种异构体即JNK1，JNK2，JNK3。JNK／SAPK可被炎性细胞因子、紫外线、热休克、氧化损伤等刺激因素激活，主要参与炎症与细胞凋亡过程。活化的JNK由胞膜转移至胞核，激活下游转录因子促进凋亡相关基因表达［17］。P38是一种38KD的酪氨酸蛋白激酶，存在于胞核和胞质中，可以磷酸化激活转录因子促进基因的表达。P38MAPK主要参与细胞凋亡，但也可促进细胞增殖，进而导致肿瘤的发生。

3.2 MAPK在肿瘤多药耐药中的研究进展

3.2.1 ERK1／2在肿瘤多药耐药中的研究 表皮生长因子（EGF）或成纤维生长因子（bFGF）可作为刺激因子与相应受体结合，通过受体蛋白酪氨酸激酶激活Ras（调节性GTP酶），活化的Ras激活Raf（MAPKK激酶）并将其定位于细胞膜，最终激活的ERK1／2从胞膜转移至胞核参与调控转录因子，完成细胞的生长、增殖、分化。近年来发现ERK通路不仅与肿瘤的发生、发展有关，也参与了肿瘤的耐药过程，其作用机制可能是通过调控MDR1基因及蛋白的表达。Kazuhiro等研究发现内源性和外源性P－gp的表达均由 MEK／ERK／RSK信号通路调节，U0126（MEK抑制剂）或者沉默RSK促进P－gp的降解而不改变MDR1基因水平，激活上述通路 后 P－gp 表 达 增 加［18］。Yang 等 研 究 发 现 人 肾 癌NIH3T3细胞外刺激激活PLC（磷脂酶C），进而通过Raf／MEK／ERK信号通路调节 MDR1mRNA 的表达［19］。Feng Yan等ERK1／ERK2能下调肝癌耐药细胞HepG2／ADM与SMMC7721／ADM 的 P－gp的表达［20］。J.Kisucka等证实敏感和耐药细胞L1210的ERK表达水平无变化，但P－ERK在耐药细胞中高表达，加入ERK抑制剂PD98059和U0126处理后，耐药细胞的p－gp表达下降［21］。

3.2.2 JNK和P38在肿瘤多药耐药中的研究 JNK接受上游信号被激活后，可以进一步激活核内转录因子c－Jun，c－Jun可通过调节MDR1、MRP1基因或蛋白水平参与耐药。c－Jun活化可下调K562／A02耐药细胞中 MDR1基因的表达［22］。隋华等人将 MDR1基因转染至 HCT8和 HCT8／V细胞，MDR1启动子的活性明显增高。加入JNK抑制剂sp600125后，HCT8／V细胞中MDR1基因启动子活性表达明显降低。结果提示阻断JNK信号通路抑制了信号转导，使人结肠癌耐药细胞的MDR1的基因表达降低，从而降低了细胞的耐药性［23］。Zhou等［24］的研究发现胃癌耐药细胞株EPG85－257RDB和胰腺癌耐药细胞株EPP85－181RDB高表达p－gp，而JNK和p－c－jun表达低于亲本细胞。在稳定转染了高表达JNK的质粒后，两种耐药细胞的MDR1基因及蛋白表达均降低，并呈时间，剂量依赖性。提示JNK能诱导耐药细胞内p－gp表达减少，胞内阿霉素、柔红霉素蓄积量明显增多。Feng Yan等［25］人成功构建了肝癌耐药细胞SMMC－7721／ADM，检测显示高表达p－gp蛋白。与亲本细胞比耐药细胞中JNK1，JNK2，JNK3 的基因表达减少，P－JNK1，PJNK2，P－JNK3蛋白表达均减少。P－JNK2／3表达越低，耐药细胞耐药性越高。提示JNK的活性与肝癌细胞耐药性呈负相关。然而，与上述结果截然不同的是在其他细胞中，JNK活化后可以刺激MRP1基因表达。小细胞肺癌GLC4细胞在阿霉素处理8小时后即有MRP1基因明显的增加，16小时即有明显的蛋白表达。其可能的机制是，阿霉素诱导JNK活化，JNK激活c－Jun，p－c－Jun与 MRP1基因启动子 AP－1相互作用进而使MRP1基因表达增多［26］。

p38MAPK参与细胞耐药可能与凋亡基因的激活，耐药基因或蛋白的改变有关。焦今文等［27］发现上皮性卵巢癌经多疗程化疗后p38MAPK通路受抑制，导致Survivin、ERCC1、LRP的表达增高，进而导致肿瘤顺铂耐药的产生。SB203580（p38抑制剂）处理后的L1210／VCR细胞对长春新碱的敏感性增加，胞内长春新碱的药物浓度增加。SB203580并没有改变 MDR1基因和p38－MAPK蛋白的表达，但是p38－MAPK的活化增强。耐药的改变可能是SB203580作用于p－gp的结果［28］。SB202190（p38－MAPK 抑制剂）通过降低转录因子 AP－1的活性来抑制 MDR1基因的表达［29］。p38－MAPK在MDR1基因表达中起的作用与细胞类型相关。ERK，JNK，P38MAPK信号通路存在着广泛的交叉作用 。而PI3K／AKT和MAPK信号通路作为与细胞生命活动密切相关的两条信号通路，彼此也存在着密切的联系，可以交叉激活。

4 PKC信号通路及在肿瘤多药耐药中的研究

PKC是一种钙和磷脂依赖的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，经第二信使激活后PKC通过磷酸化蛋白或者参与其他基因转录参与细胞的增殖、分化、凋亡等多种生物学。目前研究PKCα与肿瘤的多药耐药相关［30］。PKCα、PKCε及 P－gp在卵巢癌中表达明显高于正常、良性、交界性上皮性肿瘤的表达，复发癌组织中PKCα、PKCε及P－gp的表达明显高于初治者［31］。可能的机制如下：通过激活启动子增强 MDR1基因转录，致p－gp蛋白增多；增加p－gp磷酸化；介导 MRP1转录水平的提高。加入PKC的抑制剂Staurosporine后，细胞内MDR1的表达升高，胞内药物浓度增高。

5 其他

耐药的产生不仅与基因和蛋白表达密切相关，也与肿瘤药物被泵出胞外过程相关。阿帕替尼可以通过刺激p－gp及MRP1的ATP酶活性增强耐药细胞对阿霉素的敏感性，胞内罗丹明123蓄积量增多，并未改变MDR1及MRP1基因和蛋白水平，PI3K／AKT和 ERK信号通路也未激活［32］。YC－1能明显抑制耐药细胞中p－gp的转运功能，增加胞内药物蓄积量，且依赖于 NO／cGMP／PKG／ERK信号通路［33］。

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1007－4287（2013）02－0379－04

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2012－08－02）