蜈蚣胃蛋白酶解物体外抗凝活性肽类的分离与分析

陈保红 耿 亚 马永明

（漯河医学高等专科学校第二附属医院，河南 漯河 462300）

蜈蚣胃蛋白酶解物体外抗凝活性肽类的分离与分析

陈保红 耿 亚 马永明

（漯河医学高等专科学校第二附属医院，河南 漯河 462300）

目的 采用凝胶过滤色谱和C18反相色谱对蜈蚣胃蛋白酶解物的抗凝活性部分进行分离和纯化，并检测其相对分子质量分布范围。方法 光谱法收集各凝胶色谱并分离各流分；用活化部位的凝血活酶时间(APTT)作为指标，检测各流分体外的抗凝活性；用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测其相对分子质量的分布范围。结果 经过滤色谱和C18反相色谱纯化后得到了抗凝活性成分，并测得成分中的相对分子质量的分布范围在568～1126之间。结论 凝胶过滤色谱和C18反相色谱对蜈蚣胃蛋白酶解物的抗凝活性部分进行分离和纯化后，抗凝活性组分是小分子肽类。

蜈蚣胃蛋白酶解物；凝胶过滤色谱；C18反相色谱；抗凝活性肽

蜈蚣，民间又被称为天龙、千年虫、属节肢动物蜈蚣科，关于它的记载最早的著作是《神农本草经》，迄今已有2000年的历史。一般取蜈蚣干燥虫体入药，其本身亦有毒性，可以解毒散结、通经络止痛等功效。在临床上多用于治疗小儿惊风、疮疡、肿毒、烫伤、风癣等。除此之外，蜈蚣还有治疗心血管疾病的功用[1]。蜈蚣的提取物中的有效成分如抗凝活性肽类物质在临床上有着同样重要的功效。如使血管平滑肌舒张，改善冠脉供血[2]。在动物实验研究中显示，蜈蚣提取液对急性心肌缺血的大鼠再灌注损伤的左心功能有明显的保护作用，而且存在一定的量效关系[3]。可见，蜈蚣及其提取物对人类健康有着很大的贡献，在临床应用中有着不可估量的作用，因此，本篇实验将提取并分离的有效成分做研究，为学科发展和临床应用提高科学的理论基础。

1 资料与方法

1.1 仪器准备

分光光度计、离心机、电子分析天平、恒温水浴锅、真空干燥箱、血小板聚集凝血因子分析仪、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。

1.2 材料准备

自制蜈蚣胃酶解物、牛血清白蛋白、APTT试剂、乙醇、纯净水、C18反相填料、不同规格色谱柱、健康的大白兔。

1.3 方法

制备样品以及空白对照品，对照品即是生理盐水；在白兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠进行麻醉，后颈动脉取血，离心后取上层清液；取样品液分别加入APTT试剂，测定APTT值；对蜈蚣胃蛋白酶酶解液进行色谱分离，按色带标记为F1，F2，F3，F4。将具有抗凝活性的成分继续进行色谱分离测定药效，记录色带F3-1，F3-2，F3-3，F3-4；C18反向柱色谱分离药效成分，标记为LF1，LF2(LF2-1，LF2-2)，LF3；HPLC测定抗凝活性成分纯度；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定成分相对分子量的范围；APTT抗凝药效试验测定药效成分活性最强物质。

2 结 果

蜈蚣胃蛋白酶酶解液中F1，F2，F3为蛋白或多肽类成分，APTT药效显示F3具有抗凝活性，其中F3-3抗凝药效最好，经体外APTT分析，LF1，LF2均为具有抗凝活性的组分，其中LF2-1，LF2-2活性最强，而LF3无抗凝活性。经过分离的成分经双缩脲反应均为蛋白或多肽类成分。

3 讨 论

本实验通过多种仪器来分离纯化提取蜈蚣胃蛋白酶解物体外抗凝活性肽类，所得的小分子双缩脲反应均为肽类，故称之为小分子肽类。虽然实验过程看似复杂，实则简单易操作，且重复性好，稳定性高，实验设计严谨，可操作性强。该种方法分离小分子肽类值得推广。对于动物性药物成分的提取技术，该类实验设计和方法亦为以后的实验打下科学基础。动物性药物成分的提取对于学科发展、临床应用有着跨时代的意义，大大节省了材料资源，提高了药效，减轻了患者药物在人体内代谢的毒副作用。动物药中主要含有蛋白质、肽类以及氨基酸等物质，通过科学的酶解作用，将大分子的蛋白水解为小分子肽类，通过色谱一些列的分离技术，纯化，再提取，再分离，从而最终获得分子量很小但却有着完整的抗凝活性的小分子肽类物质，在学科发展上成为一大突破。这种技术的应用能够使分子量5000的肽类缩小成为1000以下的小分子肽类。而蜈蚣胃酶解液在葡聚糖凝胶过滤色谱SephadexG-50和G-25柱分离后，通过经APTT抗凝血药效试验筛选，得到抗凝活性最强的流分F3-3，而后通过经C18柱色谱法，依据洗脱图谱合并流分，得到了4个组分，这4个组分中，抗凝活性最强的是粉红色的LF2-1和LF2-1。

[1] 王勇炫,吴伟康,吴以岭,等.蜈蚣有效部位抗心肌缺血的NO机制研[C].贵阳:全国中药学术研讨会论文集,2009:386.

[2] 司秋菊,王鑫国,王亚利,等.蜈蚣对动脉粥样硬化家兔血管内皮细胞生长因子的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2010,1(1):5.

[3] 张明泉,王亚利,温瑞书,等.蜈蚣提取液对大鼠心脏血流动力学的作用研究[J].河北中医,2010,26(9):716.

R282

B

1671-8194（2013）20-0089-01