病毒性脑炎诊断技术的进展

黄艺婧 徐平

1 脑脊液（CSF）检查 CSF检查在VE诊断中是一种常规辅助检查方法，在与其他脑炎鉴别中至关重要。除有明确腰穿禁忌证外，临床怀疑脑炎者均应行腰穿查CSF。

1.1 细胞计数 根据福克斯罗森塔尔计数室研究［1］，为避免细胞过多裂解，总细胞计数与白细胞计数应在CSF采集后2h内进行。成年人VE的典型CSF特点为白细胞正常或轻度增高，白细胞计数为（50～500）×106／L，偶见＞1000×106／L，其中以淋巴细胞增多最为显著。婴儿VE白细胞计数多无固定值，其随着年龄增加逐渐增大［2］。在感染急性期白细胞增高以中性粒细胞为主，但因就诊时常已错过此期而临床上少见。部分单纯疱疹病毒性脑炎（herpes simplex virus encephalitis，HSE）急性感染期白细胞数多在正常范围，之后逐渐升高。肠病毒感染所致VE的CSF中白细胞计数早期亦可正常，之后数天内逐步上升。

1.2 糖及氯化物 VE患者CSF中糖和氯化物一般正常，但巨细胞病毒（CMV）、西尼罗河病毒、疱疹病毒等少数病毒感染时糖含量可减少。

1.3 蛋白质 VE患者的CSF中蛋白质水平在正常范围或轻度升高，但一般不超过0.5～1.0g／L。

1.4 细胞培养 如果条件允许，应常规进行CSF细胞培养，以确定病毒株。此法敏感性低，特异性高，易出现假阴性结果，故在临床上诊断VE时应结合其他相关检查综合考虑。也可在适当时间取咽拭子、粪便及水疱中的液体或病变拭子进行培养，但这些取材和CSF中细胞含量较少，很难达到细胞培养的要求，故临床上很少应用。

2 脑电图（electroencephalogram，EEG） EEG是诊断本病的重要依据之一。它是脑实质受累的指标，可显示大脑早期病变，通常在影像学检查显示脑实质病变前就能出现异常信号，通过EEG可观察到大脑局部异常，但其特异性不高。如EEG频率变慢（常为4～9Hz）并出现阵发性慢波、尖波或棘波，则提示病情较重。

3 病原学检查

3.1 病毒分离 此方法目前被认为是VE病原学诊断的金标准，其优点是特异性高，但操作过程复杂，成功率低，且需要患者的配合与理解，临床很难普及。

3.2 病毒特异性抗体检测 单纯疱疹病毒1、2型（HSV-1、HSV-2），水痘病毒（VZV），CMV，人类疱疹病毒6、7型（HHV-6、HHV-7），EB 病 毒 （EBV），呼 吸 道 合 胞 病 毒（RSV），人类免疫缺陷病毒（HIV），腺病毒（adenovirus），流感病毒 A、B（influenza virus A、influenza virus B），轮状病毒（rotavirus），柯 萨 奇 病 毒 （coxsachie virus）和 副 流 感 病 毒（parainfluenza virus）均可通过酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）在血清和CSF中被检测到［3］。

酶联免疫吸附试验（ELISA）用于检测病毒抗体，成功率较高。但该实验抗体常为重组蛋白，常因受细菌污染而影响检测结果的准确性。随着ELISA方法的改良，其检测敏感性有所提高，可以用于大规模血清学筛查。

蛋白质印迹法（Western blot）在多种病毒感染性疾病的诊断中被作为确诊实验，并用于识别血清和CSF中的特异性抗体。因其抗原敏感性低于新一代ELISA检测病毒抗体，故在VE诊断中未成为首选诊断技术。

3.3 病毒抗原检测 HSV，VZV，RSV，流感病毒 A、B，副流感病毒1、3以及腺病毒的抗原均可通过传统的免疫荧光（IF）法对其咽拭子标本进行抗原检测。但此方法不适用于CSF标本，因为CSF中抗原含量较低，很难被检出。

免疫组织化学（IHC）是检测组织中抗原的常用方法，广泛应用于定性实验，可通过显微镜直观的看到组织中是否存在相关抗原，其效果稳定。

新型ELISA方法基于双抗体夹心模式，也可应用于病毒检测。2001年Bode等［4］报道用该方法检测博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）的磷蛋 白（p24）和核蛋 白（p40）的构象表位。该方法检测BDV抗原具有较高敏感性和特异性，并保持了ELISA法的高稳定性、操作方便的优点，也可以试用于检测其他病毒 。

3.4 联合检测 三联-ELISA检测即特异性循环免疫复合物（CIC）、相关游离抗体和血浆抗原的检测。Bode等［4］的研究揭示BDV-CIC、相关游离抗体和血浆抗原（p40／p24）检测相同样本阳性率的差异。该研究发现检测CIC阳性率明显高于抗体和抗原的阳性率，表明此病毒在机体内通过抗原－抗体免疫反应后大多形成CIC，以CIC形式引发机体的免疫反应，这可能也解释了BDV持续感染的免疫机制。此方法检测感染阳性率比单纯血清学检测高10倍以上［5］，可能是现代病原学诊断的一个新趋势。

4 基因组学诊断 基因组学在病毒性疾病的研究和诊断中的应用越来越广泛，为诊断VE开辟了传统病原学诊断方法以外的新途径，特别是聚合酶链反应（PCR）技术的高敏感性和高特异性，使VE的诊断技术有更大的进步。基因诊断是利用DNA分析技术，直接从基因水平（DNA或RNA）检测患者的基因缺陷。2011年福建省对引起VE的肠道病毒Echo30进行了反转录聚合酶链反应（RT-PCR）序列分析鉴定Echo30血清型，测定并分析其扩增产物的序列。结果显示其扩增产物的序列与不同地区、时间的流行株的基因序列进行比较发现3个位点氨基酸出现了变异［6］。近来有研究发现血管内皮细胞生长因子（VEGF）的＋405G／C位点多态性与VE的易感性有关［7］。PCR技术是最便捷的核酸检测方法。随着其应用范围逐渐扩大，实验种类从最初的RT-PCR增加到与其他各项技术相结合而发展起来的巢式反转录荧光定量PCR（FQ-nRT-PCR）、实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR）、多重 RTPCR（multiplex PCR）等多种方法。

PCR是扩增DNA的方法之一，用于RNA检测时需先将RNA转录成互补的DNA。常规RT-PCR分反转录和cDNA扩增两个步骤进行，一步法RT-PCR则是在RTPCR基础上进一步改进，该方法在同一反应体系中，同时进行反转录及PCR反应，从样品RNA提取、反转录、PCR扩增到电泳观察的全部过程可在短时间内完成，并且可以精确、快捷地扩增出目的片段，适合大规模推广。但检测时要注意反应温度，较低温度可使RNA形成二级结构而降低RT-PCR检测率。

FQ-nRT-PCR技术检测病毒基因片段具有诸多优点，如特异性高、灵敏性高、稳定性好、重复性好、操作简便和快捷等。它克服了RT-PCR只能定性不能定量、容易污染而产生假阳性、需通过电泳观察结果以及溴化乙啶对人体有害等缺点。此外，其在病毒复制水平及抗病毒治疗疗效评估方面具有重要临床价值。

实时荧光定量PCR以敏感性高、特异性高、污染少、可定量等优点著称，其中目前常用于检测各种病毒主要有Taq Man探针法和SYBR GreenⅠ染料法。SYBR GreenⅠ是一种双链DNA结合染料，它结合到双链DNA后可使其荧光强度增加1000倍以上［8］，从而保证荧光信号增加与PCR产物增加同步。Taq Man real-time PCR优势在于利用上、下游引物及与目的模板互补的探针使反应特异性具有双重保证，克服了SYBR GreenⅠ法存在假阳性的缺陷，从而使检测结果更加可靠。

5 影像学检查 影像学检查是VE诊断的重要辅助手段。它能够及早发现VE病灶及其侵犯范围，为早期诊断和治疗提供直观依据。目前常用的影像学检查方法主要是MRI和CT。MRI准确率及敏感性较CT高，但MRI要求患者高度配合，偶尔的抽动都会对影像质量产生较大影响，因此对于不易控制抽动的小儿，CT是首选检查。

VE的好发部位主要是额、颞、枕叶的近皮层区，有时可同时累及灰白质。CT检查主要表现为病变区平扫呈低密度灶，MRI主要表现为病变区的长T1及长T2信号。增强扫描CT与MRI均为呈线状及条片状强化居多。治疗后如强化的区域减少，则提示病情好转。近年来，MRI扩散加权成像（diffusiong weighted imaging，DWI）、磁共振波谱（1H MRS）和磁敏感加权成像（SWI）的应用对 VE诊断提供了更多依据。Sawlani［9］曾对45例确诊VE患者行DWI检查，结果显示在VE急性期表现为病灶范围和异常弥散程度的多样性，且均表现为高信号。

总之，通过样本检测抗原、抗体和免疫复合物为VE提供了诊断依据，通过分子生物学技术在CSF和血液中检测病毒的应用，为VE提供了病原学依据。另外，多重分析、基因芯片和微流体技术的广泛使用，也可能为未来诊断VE提供更简便的方法。尽管如此，VE的病原学与基因组学诊断仍然充满挑战。希望今后能出现更有效的病原学诊断方法，以更好的明确诊断。

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