细胞外信号调节激酶的磷酸化水平对星形胶质细胞增殖及其细胞周期的影响

苑召虎 胡子有 王惠丽 吴炳义

星形胶质细胞（Ast）是中枢神经系统（CNS）中数量最多的细胞，约占健康成人CNS细胞总数的40%，Ast能合成及分泌多种神经活性物质，为神经元及其他胶质细胞相互作用提供相对稳定的内环境，在维持神经元内外环境稳定、轴突生长等方面具有重要作用，与 CNS疾病密切相关［1－3］。

CNS能对外界各种刺激作出不同程度的应激反应，具有很强的适应和恢复能力。然而，各种CNS损伤，如脑外伤、脑卒中和神经退行性疾病等可引起活化的炎性细胞释放细胞因子从而激活ERK1／2信号通路，将信号从细胞膜表面受体转导至细胞核，导致细胞的增殖与分化的改变［4］。这些改变促进了损伤部位Ast的过度增殖，最终形成胶质疤痕，阻碍新生神经元轴突的再生及连接，从而影响脑功能恢复。胶质疤痕是神经损伤后神经元退行性变最重要的影响因素，可视为神经损伤后的第三位病变［5－6］。因此，探究 ERK1／2信号通路在Ast增殖及其细胞周期调控中的作用，为胶质疤痕的治疗寻求一种可能的途径，具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：1日龄雄性SD乳鼠9只，购自南方医科大学实验动物研究中心。

1.1.2 主要试剂与仪器：小鼠源性胶质纤维酸性蛋白（GFAP）单克隆抗体（按1∶100体积比例稀释）购自Thermo Fisher Scientific公司；小鼠源性GAPDH单克隆抗体（按1∶1000体积比例稀释）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔源性p－ERK1／2以及ERK1／2多克隆抗体（均按1∶1000体积比例稀释）购自Epitomics公司；羊抗兔及羊抗小鼠IgG IR Dye 800cw二抗（均按1∶15 000体积比例稀释）购自Odyssey公司；FITC-羊抗小鼠的纯化二抗（按1∶100体积比例稀释）购自Jackson公司；U0126，即ERK1／2磷酸化的特异性抑制剂购自Enzo Life Science；细胞周期试剂盒购自BD公司；正常山羊血清封闭液购自Boster公司；DMEM培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；智能激光扫描共聚焦显微镜（OLYPMUS FV10i-W），流式细胞仪（BD LSRFortessa），Western Blot扫膜系统（Odyssey LI-COR）。

1.2 方法

1.2.1 Ast的原代培养及鉴定：取SD鼠3只，无菌操作下取其大脑组织，体视镜下分离大脑皮层，剪碎，匀浆，过滤后以4.5×105／mL细胞密度种于35mm2培养皿内。将培养4周的成熟的Ast［7］，弃去培养液，用PBS洗3次，用4%（质量浓度）多聚甲醛室温下固定40min后用羊血清封闭1h，PBS洗3次之后加入0.5mL 1∶100稀释的兔源性GFAP一抗，室温下孵育2h，PBS洗5次后加入0.5mL 1∶100稀释的FITC标记的羊抗小鼠的二抗，室温下孵育1h，PBS洗3次后，在荧光倒置显微镜下观察Ast的染色状况以作纯度鉴定，GFAP阳性细胞呈绿色荧光。200倍荧光显微镜下计数10个视野的阳性细胞数，计算其与200倍普通光镜下总细胞的比值，即细胞纯度［7］。经鉴定培养的原代Ast合格（纯度≥95%），可用于后续实验。Ast的原代培养及鉴定重复3次。

1.2.2 两组观察指标检测：将培养成熟的大鼠原代Ast分为U0126组和对照组两组。U0126组Ast弃去培养基，加入2mL 含60mmol／L U0126［8］、10% （体 积 分 数）FBS 的 DMEM，置37℃，5%（体积分数）CO2孵箱中培养24h；对照组不加U0126，余处理相同。

（1）Western Blot检测两组ERK1／2磷酸化水平：将上述两组细胞用冰PBS洗涤3次，然后用含1%（体积分数）蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，按常规方法进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF膜，一抗为小鼠源性GAPDH单克隆抗体、兔源性p-ERK1／2多克隆抗体和兔源性ERK1／2多克隆抗体，二抗为羊抗鼠及抗兔IgG IR Dye 800cw二抗，孵育后，将PVDF膜置于Odyssey扫膜系统进行扫描，得到有目的蛋白（p－ERK1／2及ERK1／2均为两条蛋白条带，相对分子质量（Mr）分别为42 000、44 000）与内参蛋白（GAPAH，Mr为37 000）条带的 Westren bolt图片后，将该图片导入到gel-pro analyzer软件检测目的蛋白条带和内参的灰度值，以目的条带与内参GAPDH灰度值的比值作为该组ERK1／2磷酸化水平的相对表达量。每次实验每组检测3次。

（2）Click-iT Edu检测两组 Ast增殖情况：将上述两组细胞半量换液，加入1mL含20μmol／L EdU、10%（体积分数）FBS的低糖 DMEM，使EdU终浓度为10μmol／L。将其置于37℃，5%（体积分数）CO2培养箱中培养24h后弃去培养液，加入3.7%（体积分数）甲醛1mL，室温下固定15min，弃去固定液，用3%（质量分数）BSA洗2次。然后加入 0.5%（体积分数）Triton X-100 1 mL室温下孵育20min；弃去通透液，用3%（质量分数）BSA 洗2次。然后加入0.5mL Click-iT 反应混合液，室温下避光振荡30min，弃去反应液，用3%（质量分数）BSA洗1次。然后再加入1X Hoechst 33342反应液1mL室温下避光反应30 min。用PBS清洗2次后，于激光共聚焦显微镜下拍照分析并计算其增殖细胞百分比，计算公式为：Ast增殖细胞百分比＝（增殖的细胞数目／总细胞数目）×100%。其中细胞核着红色荧光的为增殖细胞，细胞核着蓝色荧光的为未增殖细胞。每次实验每组检测3次。

（3）流式细胞术检测各细胞周期Ast百分比：将上述两组细胞弃去培养液，PBS洗2遍，用0.25%（质量浓度）胰酶消化处理后，收集悬浮细胞于室温下以400g离心5min。弃上清，加入250 μL胰酶溶液（A液），用手指轻弹将其混匀，室温下反应10min。然后再加入200μL的胰酶抑制剂和核糖核酸酶的混合液（B液），用手指轻弹将其混匀，室温下反应10min。最后加入200μL冰冷的PI染液（C液）用手指轻弹将其混匀，4℃避光反应10min。然后将其在3h内上流式细胞仪检测，读取并记录两组细胞在G1期、S期和G2期的细胞百分比。每次实验每组检测3次。

（1）～（3）的实验均重复3次，计算平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行分析。数据均以均数±标准差表示。两组间各指标比较采用两样本t检验。以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 两组 ERK1／2磷酸化水平 U0126组ERK1／2的磷酸化水平（39.13%±6.71%）明显低于对照组（100%）（t＝15.71，P＜0.01），ERK1／2蛋白表达水平与对照组相比无统计学差异（t＝0.153，P＞0.05）（图1）。

图 1 两组ERK1／2磷酸化水平比较（Western blot）

2.2 两组Ast增殖情况 对照组增殖细胞布满整个视野，U0126组则增殖细胞零星可见（图2）。U0126组 Ast增殖细胞百分比〔（2.63±1.14）%〕低于对照组〔（21.43±3.81）%〕（t＝21.13，P＜0.01），约为对照组的1／7。

图2 两组Ast增殖情况：红色的为Click-iT Edu染色（×200），为增殖细胞；蓝色的为 Hoechst 33342染色（×200），为未增殖细胞

2.3 两组Ast不同细胞周期增殖情况检测 G1期 U0126组 Ast〔（93.67±0.68）%〕高于对照组〔（84.63±1.00）%〕（t＝12.91，P＜0.01）；S 期U0126组 Ast〔（2.90±0.23）%〕低 于 对 照 组〔（14.21±1.14）%〕（t＝16.87，P＜0.01）；G2期U0126组 Ast〔（3.43±0.88）%〕高 于 对 照 组〔（2.08±0.21%）%〕（t＝4.35，P＜0.05）。

3 讨论

Ast是CNS中最主要的细胞成分之一，它为CNS功能的发挥提供了相对稳定的内环境。外界各种刺激均可引起Ast过度增殖，最终形成胶质疤痕，成为神经损伤后神经元退行性变最重要的影响因素，严重影响脑功能的恢复。

本研究发现，用ERK1／2磷酸化的特异性抑制剂U0126降低Ast ERK1／2的磷酸化水平后，能明显降低Ast的增殖细胞百分比，抑制Ast的增殖；研究中还发现降低Ast ERK1／2的磷酸化水平可显著增高G1期和G2期Ast的百分比，同时降低S期Ast的百分比。

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族是一系列丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，包括Raf（又称为MAPKKK，即 MAPKK 激酶）、MEK（又称为MAPKK，即MAPK激酶）及ERK。其中，ERK具有广泛的生物学活性，是细胞外刺激向细胞内信号转导的交汇点，可经细胞生长因子及G蛋白耦联受体等途径激活。当细胞因子与受体结合后，可依次激活大鼠肉瘤（Ras）蛋白／Raf／ERK［9－10］。细胞接受细胞外信号有效刺激以后，可启动细胞的信号转导通路，通过多种途径将信号传递至细胞核内，促进或抑制靶基因的表达，在细胞周期的调控中起着重要作用。Krishan等［11］为研究ERK1／2的磷酸化水平对Ast增殖的影响，用U0126抑制Ast ERK1／2的磷酸化，降低ERK1／2的磷酸化水平后，发现Ast细胞核中含胸腺嘧啶脱氧核苷类似物Edu的Ast比例明显降低，即降低ERK1／2磷酸化水平可明显抑制Ast增殖，阻断其DNA合成。

细胞周期分为G1期、S期、G2期和M期。细胞周期中有两个主要调控点：一是G1期→S期转折点，即细胞从静止状态进入DNA合成期的调控点；另一调控点为G2期→M期的转折点，即细胞一分为二的调控点。本研究中发现降低Ast ERK1／2的磷酸化水平后，G1期Ast百分比明显增加，同时S期Ast百分比降低，提示Ast从G1期向S期的转化被阻断，即Ast的增殖被阻断在DNA合成前期（即G1期）；G2期Ast百分比增高，提示Ast从G2期向M期的转化被阻断，即将Ast的增殖阻断在G2期，抑制Ast分裂。

细胞内周期因子依赖性激酶（CDK）控制着细胞周期各时相之间的顺序转换，其活性由周期素（cyclin）激活，此两者起着正向调节的作用。细胞周期的负向调节因子主要是细胞内周期因子依赖性激酶抑制物，即CDK的抑制物（CDIs）。有研究者发现细胞周期调控因子25A（CDC25A）的下调可降低细胞内周期因子依赖性激酶2（CDK2）-细胞周期素E（cyclin E）活性，进一步降低活性视网膜母细胞瘤抑制蛋白（Rb）的磷酸化水平，从而抑制其细胞周期的转化，将其阻断在 G1期［12－13］。Timofeev等［14］研究发现CDC25磷酸化水平下调可降低胞内周期因子依赖性激酶1（CDK1）-细胞周期素B（cyclin B）的活性从而抑制其细胞周期G2期→M期的转化，将其阻断在G2期。

既往研究发现，降低ERK1／2磷酸化水平能通过影响CDC25A／CDK2的磷酸化水平阻断G1期向S期转化［15］，也可通过降低细胞周期调控因子25C（CDC25C）活性可以阻断G2期向 M期转化［16］，因此推测降低 Ast ERK1／2的磷酸化水平也可通过影响CDC25A／CDK2和CDC25C这两条信号途径来抑制Ast的增殖，分别将其抑制在G1期和G2期，但具体的信号通路仍需进一步研究探索。综上，本研究发现，降低ERK1／2磷酸化水平能明显抑制Ast增殖，对胶质疤痕的干预治疗提供了初步的实验室依据。

［1］Sharma G，Vijayaraghavail S.Nicotinic cholinergic signaling in hippocampal astrocytes involves calcium induced calcium release from intraeellular stores［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（7）：4148-4153.

［2］Voutsinos PB.Bonvento G，Tanaka K，et a1.Glial glutamate transporters mediate a functional metabolic crosstalk between neurons and astrocytes in the mouse developing codex［J］.Neuron，2003，37（2）：275-286.

［3］Emsley JG，Arlotta P，Macklis JD.Star-cross'd neurons：astroglial effects on neural repair in the adult mammalian CNS［J］.Trends Neuro Sci，2004，27（5）：238-240.

［4］马莲环，刘建.ERK1／2的研究进展［J］.国外医学（生理、病理科学与临床分册），2005，25（3）：279-282.

［5］Sofroniew MV，Vinters HV.Astrocytes：biology and pathology［J］.Acta Neuropathol，2010，119（1）：7-35.

［6］Leal-Filho MB.Spinal cord injury：From inflammation to glial scar［J］.Surg Neurol Int，2011，2：112.

［7］Wu BY，Liu RY，So KL，et al.Multilipofection efficiently transfected genes into astrocytes in primary culture［J］.J Neurosci Methods，2000，102（2）：133-141.

［8］Lichtenstein MP，Carriba P，Baltrons MA，et al.Secretaseindependent and Rho GTPase／PAK／ERK-dependent regulation of cytoskeleton dynamics in astrocytes by NSAIDs and derivatives［J］.J Alzheimers Dis，2010，22（4）：1135-1155.

［9］Han BH，Hohzman DM.BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway［J］.J Neurosci，2000，20（15）：5775-5781.

［10］Widmann C，Cilbon S，Jarpe MB，et a1.Mitogen-activated protein kinase：conservation of a three-kiase module from yeast to human［J］.Phys Rev，1999，79（1）：143-180.

［11］Krishan A，Hamelik RM.Click-iT proliferation assay with improved DNA histograms［J］.Curr Protoc Cytom，2010，7（36）：1-7.

［12］Wang Y，Shenouda S，Baranwal S，et al.Integrin subunits alpha5and alpha6regulate cell cycle by modulating the chk1 and Rb／E2Fpathways to affect breast cancer metastasis［J］.Mol Cancer，2011，10：84-95.

［13］Brichkina AI，Aksenov ND，Pospelov VA，et al.Analysis of transient G1／S arrest in E1A＋E1B-19kDa transformed cells after ionizing radiation［J］.Tsitologiia，2003，45（12）：1203-1210.

［14］Timofeev O，Cizmecioglu O，Settele F，et al.Cdc25phosphatases are required for timely assembly of CDK1-cyclin B at the G2／M transition［J］.J Biol Chem，2010，285（22）：16978-16990.

［15］Lee JG，Kay EP.PI 3-kinase／Rac1and ERK1／2regulate FGF-2-mediated cell proliferation through phosphorylation of p27at Ser10by KIS and at Thr187by Cdc25A／Cdk2［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52（1）：417-426.

［16］Wang R，He G，Nelman-Gonzalez M，et al.Regulation of Cdc25Cby ERK-MAP kinases during the G2／M transition［J］.Cell，2007，128（6）：1119-1132.