T淋巴细胞受体与多发性硬化

张纪红 董会卿

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种常见的中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘疾病，其病因尚未明确，目前倾向认为是自身免疫相关性疾病。MS的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠研究发现CD4＋T淋巴细胞在EAE起病及进展中均有重要作用［1］；Th1及Th17细胞能够转移到中枢神经系统并且分泌细胞因子导致髓鞘脱失及轴索丧失［2］。CD8＋T淋巴细胞在MS发病中也有重要作用，可以杀伤胶质细胞、暴露／横断轴索、增加血管通透性、促进少突胶质细胞死亡［2］。T淋巴细胞增殖数量与患者扩展残疾状态评分（expanded disability status scale，EDSS）及复发次数呈正相关，与缓解期长短呈负相关［3］。T淋巴细胞的免疫活动基本通过T淋巴细胞受体（T cell receptor，TCR）实现，因此可以通过监测TCR来监测MS患者的免疫状态。

1 TCR

T淋巴细胞起源于骨髓多能造血干细胞，多能造血干细胞发育为前T淋巴细胞后转移到胸腺完成成熟过程，其中TCR随机重排，产生可以识别多种不同抗原的TCR。通常情况下，体内表达某一特异性TCR的T淋巴细胞克隆仅占总T淋巴细胞库的1／（104～105），其被相应抗原激活后克隆扩增产生大量效应细胞，后者离开淋巴器官随血液循环到达相应部位。

TCR表达于所有T淋巴细胞表面，由αβ或γδ两条肽链构成，前者占成熟T淋巴细胞的90%～95%。每条链分为可变区（variable region，V区）与恒定区（constant region，C区），抗原特异性存在于V区，V区上互补决定区（complementarydeterminingregion，CDR）决定TCR的抗原特异性，其中CDR3变异最大。TCRβ链基因位于7号染色体的7q32-35区，约有67个基因，其中47个有功能的基因被分为23个功能性基因家族。

2 TCRβ链可变区（TCRVβ）实的验室研究方法

2.1 PCR方法 CDR3谱型分析［4］是最常用的方法。以流式细胞仪等方法从患者的脑脊液或外周血中分离出T淋巴细胞，获取mRNA，反转录为cDNA，用TCRVβ引物（荧光标记）进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，产物在丙烯酰胺凝胶上电泳，用影像荧光分析仪记录分析。健康人可形成8～10个条带并呈正态分布，MS患者可出现1个或多个扩增条带。从凝胶上获取扩增条带，再次进行PCR扩增（为减少误差，一般扩增5个循环），用基因扫描软件进行分析，获得单峰图像者为单克隆性，有1个主峰及少数次主峰者为寡克隆性，有多个峰而无明显主峰者为多克隆性。另外，用于TCRVβ研究还有单克隆抗体方法［5］，目前采用TCRVβ单克隆抗体试剂与样本特异性抗原抗体反应，之后经流式细胞仪分析即可检测出该样本表达的TCRVβ并计算出表达水平。

2.2 动物实验 TCRVβ的一些研究是在EAE动物模型上进行的。有研究者在小鼠EAE形成过程中观察TCRVβ变化，发现其淋巴结、脾、脊髓中有 TCR Vβ8.2及 Vβ16克隆性扩增，在出现症状前即出现，症状消失恢复至正常时消失［6］。转基因TCRVβ6（鼠8.6）的T淋巴细胞有中枢性及周围性免疫耐受；转基因Vβ8（鼠8.8）的T淋巴细胞则逃离中枢性及周围性免疫耐受，并对碱性髓鞘蛋白（myelin basic protein，MBP）79－87发生反应而大量增殖［7］。

动物模型的遗传背景与人类有一定差距，而且人MS患者发病也受到环境、心理等因素影响，因此对MS患者TCRVβ具体表现的研究仍有待于临床研究。

3 临床研究

自20世纪80年代末即有TCRVβ相关研究，到目前为止，许多TCRVβ相关研究，多针对免疫相关疾病如风湿病、白血病、肿瘤、乙肝等传染病及MS等。MS患者不论处于哪个阶段，如临床孤立综合征（clinically isolated syndrome，CIS）、临床刚确定的MS或恶化进展阶段，其TCRVβ的表达均与健康人存在显著不同。

3.1 健康人的TCRVβ表现 T淋巴细胞发育过程中，TCRVβ基因随机重排，健康人TCRVβ一般呈多样性，不存在扩增的 TCRVβ［8－9］。但有些健康人会有1个或以上TCRVβ克隆性扩增［10］，并与年龄有一定关系，20～30岁者无克隆性扩增，40～50岁者会有1～2个克隆性扩增，其中TCRVβ9克隆性扩增较常见［4］。健康人克隆性TCRVβ扩增的T淋巴细胞对MBP不会发生反应［11］，这提示健康人的TCRVβ扩增针对的是非MS抗原或被免疫调节机制所控制，这种现象可能与年龄较大者所接触的病原体及疫苗接种等较多有关。

3.2 不同MS临床分型的TCRVβ表现 MS不同临床分型的研究目前尚处于探索阶段，不同临床分型MS患者的TCRVβ表现有所不同，疾病缓解期也可见TCRVβ克隆性扩增，长时间缓解后可恢复到正常［4］。糖皮质激素（激素）及免疫调节剂对T淋巴细胞均有影响。多数研究中要求采集标本前应至少3个月［12］（也有的研究要求6周即可［8］）未使用激素治疗；从未接受免疫抑制剂或免疫调节剂［12］，也有研究要求前3个月未使用免疫抑制剂即可［10］。

3.2.1 CIS：Mandel等［13］的研究中，12例 CIS患者均于首发症状出现3个月内采集外周血，用髓磷脂抗原刺激40～45d，其T淋巴细胞出现TCRVβ6-Vβ9克隆性扩增，与健康对照组比较有统计学差异。Démoulins等［14］的研究中仅1例表现为CIS，其脑脊液TCRVβ有克隆性扩增，其中TCRVβ13、Vβ15、Vβ20-23为单克隆性，TCRVβ7、Vβ11、Vβ12为寡克隆性；其外周血TCRVβ无克隆性扩增，用 MBP84－102刺激6d后，TCRVβ8、Vβ9、Vβ13呈单克隆性扩增，另有数个TCRVβ为寡克隆性扩增；用 MBP139－164刺激6d后未出现单克隆性扩增的TCRVβ；用人源化 MBP刺激6d后，TCRVβ13呈单克隆性扩增［14］。

3.2.2 复发－缓解型 MS（relapsing-remitting MS，RRMS）：Biegler等［12］的研究中，4例 RRMS患者均至少有1个主要克隆性TCRVβ存在（占所有受体的10%以上），但个体差异较大。CD4＋及CD8＋T淋巴细胞的 TCRVβ4、Vβ5、Vβ7、Vβ9及 Vβ11均明显高表达，TCRVβ3及 Vβ27明显低表达［12］。另一项研究中有9例RRMS患者，其TCRVβ5.2、Vβ8、Vβ12.2、Vβ16及 Vβ21均呈明显克隆性扩增［10］。

澳大利亚的一项研究对较多报道的克隆性扩增的TCRVβ在MS患者与健康人之间进行比较［15］，在 122 例 RRMS 与 96 名 健 康 人 的TCRVβ8.1、Vβ11、Vβ6.5、Vβ8.1、Vβ10.1、Vβ15.1及 Vβ3.1 的表达 中，两 组 TCRVβ8.1、Vβ10.1、Vβ15.1及Vβ3.1均有克隆性扩增，但扩增水平不同，患者组扩增程度更高，以TCRVβ8.1扩增最显著，其次为 TCRVβ8.1／Vβ3.1［15］。

3.2.3 继 发 进 展 型 MS（secondary－progressive MS，SPMS）：对1例SPMS患者尸检发现脑中急、慢性期病灶、脊髓病灶及表观正常白质中均有TCRVβ克隆性扩增［16］。与慢性期及正常表观白质相比，急性病灶的TCRβ链的表达相对更多［16］。

对83例高加索SPMS患者的研究发现，与197例健康高加索人相比前者的TCR Vβ8.1及Vβ11显著性克隆性扩增，并使罹患MS的相对风险增加4.06倍［17］。另一项针对3例SPMS患者的研究发现其 TCRVβ15、Vβ17、Vβ18、Vβ19呈克隆性扩增［10］。

3.2.4 原发进展型 MS（primary－progressive MS，PPMS）：Matsumoto等［4］的研究中有42例 MS患者，其中 RRMS 35例、PPMS 2例、SPMS 5例，采血时间距发病6个月至15年，发现无克隆性扩增患者4例均为20～30岁复发阶段的RRMS患者，其余患者均有至少1个克隆性扩增的TCRVβ，以TCRVβ5.2最常见，其次为 TCRVβ1、Vβ9、Vβ11及 Vβ24；与健康人相比，TCRVβ5.2及 Vβ24的扩增最显著；脑脊液T淋巴细胞也有Vβ5.2克隆性扩增［4］。

一项研究中用 TCRVβ5.2／6.5／13.1三联多肽治疗23例从未接受治疗的MS患者，1年后10／11例 RRMS、3／3例 PPMS、6／9例SPMS患者病情无加重并且体内免疫活动下降，1例RRMS及3例SPMS患者病情有进展［18］。该研究表明不同类型的MS患者可能存在相同TCRVβ克隆性扩增，但仍需要后续研究进一步明确。

3.2.5 进展复发型 MS（primary-relapsing MS，PRMS）：该类型发病率较低，对其TCRVβ研究较少。一项研究以患者的健康亲属为对照，发现DRw15＋PRMS患者（DRw15的基因组名为HLA-DRBI＊1501）的 TCRVβ8-Vβ11基因表达显著增多，TCRVβ1-Vβ8在 DRw15－PRMS患者中显著增多［19］。这项研究表明，患者的遗传背景不同其扩增的TCRVβ可能也不相同。

至今未有针对MS分型特异性TCRVβ的报道。Laplaud等［10］报道，SPMS与 RRMS克隆性扩增的TCRVβ可能无差异，但RRMS患者克隆性扩增数目更多且扩增程度更显著；克隆性扩增的均数在 RRMS为3.2±3.1，在 SPMS为1.3±1.0［8－9］。另一项研究发现，随着临床病情的加重，TCRVβ克隆性扩增数目及扩增程度均增加［11］，但其具体关系仍有待于进一步研究明确。

3.2.6 MS TCRVβ表现与视神经脊髓炎（NMO）的比较：Warabi等［9］对11例 NMO患者（缓解-复发病程）、13例RRMS患者、8例SPMS患者（病程大于8年）及25名健康人进行研究，发现NMO、MS患者及健康人均有克隆性扩增的TCRVβ，但克隆性扩增的数目不同，扩增的均数MNO为6.0±3.2，MS患者为2.5±2.7，健康人为0.9±1.1。与MS相比，TCRVβ1及TCRVβ13在NMO患者中有更高的扩增，克隆性扩增的TCRVβ数目与NMO患者EDSS有相关性［9］。

3.3 治疗对MS患者TCRVβ的影响 MS的治疗方法有激素、免疫调节剂、免疫抑制剂治疗及造血干细胞移植等。目前仅有观察醋酸格拉替雷（glatiramer acetate，GA）及造血干细胞移植治疗前后TCRVβ变化的研究报道。

Berthelot等［20］报道，10例RRMS患者与7名健康者人每日皮下注射GA，10例患者在GA治疗前均有TCRVβ克隆性扩增，分别于治疗后3个月、24个月及34个月再次采集样本分析，发现克隆性扩增的TCRVβ仍存在，扩增程度有所下降，但无统计学差异。该研究提示GA对MS的治疗作用可能不是通过T淋巴细胞实现的。

Dubinsky等［21］的研究中，4例 MS患者移植前均有寡克隆性扩增的TCRVβ，自体造血干细胞移植后随访其TCRVβ变化，3例寡克隆性扩增的TCRVβ持续存在，并呈多态性增加；1例患者寡克隆性扩增的TCRVβ在移植后2年呈现多态性。另一项研究发现，自体造血干细胞移植后至少需要两年克隆性扩增的TCRVβ才恢复到正常的多态性［22］。

MS患者TCRVβ的研究倾向认为MS患者TCRVβ会有克隆性扩增，其扩增的TCRVβ各研究发现有一定差异，不同患者之间也有异质性，其差异性可能与研究的样本量较小有关。

TCRVβ对于监测MS患者的临床病程有一定意义，新的克隆性扩增TCRVβ的出现与强化病灶的出现相关［10］，病情稳定患者克隆性扩增的TCRVβ不会发生改变，原来TCRVβ的进一步扩增或新克隆性扩增TCRVβ的出现可能预示着疾病复发。

国外已有将常见克隆性扩增的TCRVβ识别肽制作成疫苗并用于临床试验，并显示了一定的疗效及安全性。国内尚无MS的TCRVβ的研究报道，考虑到种族的差异性，我国 MS患者TCRVβ的表现可能不同，研究中国人MS患者TCRVβ具有重要意义并且是亟需的。

［1］Kuerten S，Lehmann PV.The immune pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis：lessons learned for multiple sclerosis［J］.J Interferon Cytokine Res，2011，31（12）：907-916.

［2］Loma I，Heyman R.Multiple sclerosis：pathogenesis and treatment［J］.Curr Neuropharmacol，2011，9（3）：409-416.

［3］Grau-López L，Ra ch D，Ramo-Tello C，et al.Specific T-cell proliferation to myelin peptides in relapsing-remitting multiple sclerosis［J］.Eur J Neurol，2011，18（8）：1101-1104.

［4］Matsumoto Y，Yoon WK，Jee Y，et al.Complementarity-determining region 3spectratyping analysis of the TCR repertoire in multiple sclerosis［J］.J Immunol，2003，170（9）：4846-4853.

［5］Beck RC，Stahl S，O'Keefe CL，et al.Detection of mature T-cell leukemias by flow cytometry using anti-T-cell receptor V beta antibodies［J］.Am J Clin Pathol，2003，120（5）：785-794.

［6］Menezes JS，van den Elzen P，Thornes J，et al.A public T cell clonotype within a heterogeneous autoreactive repertoire is dominant in driving EAE［J］.J Clin Invest，2007，117（8）：2176-2185.

［7］Ji Q，Perchellet A，Goverman JM.Viral infection triggers central nervous system autoimmunity via activation of CD8＋T cells expressing dual TCRs［J］.Nat Immunol，2010，11（7）：628-634.

［8］Gran B，Gestri D，Sottini A，et al.Detection of skewed T-cell receptor V-beta gene usage in the peripheral blood of patients with multiple sclerosis［J］.J Neuroimmunol，1998，85（1）：22-32.

［9］Warabi Y，Yagi K，Hayashi H，et al.Characterization of the T cell receptor repertoire in the Japanese neuromyelitis optica：T cell activity is up-regulated compared to multiple sclerosis［J］.J Neurol Sci，2006，249（2）：145-152.

［10］Laplaud DA，Berthelot L，Miqueu P，et al.Serial blood T cell repertoire alterations in multiple sclerosis patients；correlation with clinical and MRI parameters［J］.J Neuroimmunol，2006，177（1-2）：151-160.

［11］Laplaud DA，Ruiz C，Wiertlewski S，et al.Blood T-cell receptor beta chain transcriptome in multiple sclerosis.Characterization of the T cells with altered CDR3length distribution［J］.Brain，2004，127（5）：981-995.

［12］Biegler BW，Yan SX，Ortega SB，et al.Clonal composition of neuroantigen-specific CD8＋and CD4＋T-cells in multiple sclerosis［J］.J Neuroimmunol，2011，234（1-2）：131-140.

［13］Mandel M，Achiron A，Tuller T，et al.Clone clusters in autoreactive CD4T-cell lines from probable multiple sclerosis patients form disease-characteristic signatures［J］.Immunology，2009，128（2）：287-300.

［14］Démoulins T，Mouthon F，Clayette P，et al.The same TCR（N）Dbeta（N）Jbeta junctional region is associated with several different vbeta13subtypes in a multiple sclerosis patient at the onset of the disease［J］.Neurobiol Dis，2003，14（3）：470-482.

［15］Buhler MM，Bennetts BH，Heard RN，et al.T cell receptor beta chain genotyping in Australian relapsing-remitting multi-ple sclerosis patients［J］.Mult Scler，2000，6（3）：140-147.

［16］Montes M，Zhang X，Berthelot L，et al.Oligoclonal myelinreactive T-cell infiltrates derived from multiple sclerosis lesions are enriched in Th17cells［J］.Clin Immunol，2009，130（2）：133-144.

［17］Beall SS，Biddison WE，McFarlin DE，et al.Susceptibility for multiple sclerosis is determined，in part，by inheritance of a 175-kb region of the TCR V beta chain locus and HLA classⅡ genes［J］.J Neuroimmunol，1993，45（1-2）：53-60.

［18］Vandenbark AA，Culbertson NE，Bartholomew RM，et al.Therapeutic vaccination with a trivalent T-cell receptor（TCR）peptide vaccine restores deficient FoxP3expression and TCR recognition in subjects with multiple sclerosis［J］.Immunology，2008，123（1）：66-78.

［19］Hockertz MK，Paty DW，Beall SS.Susceptibility to relapsing－progressive multiple sclerosis is associated with inheritance of genes linked to the variable region of the TCR beta locus：use of affected family-based controls［J］.Am J Hum Genet，1998，62（2）：373-385.

［20］Berthelot L，Miqueu P，PettréS，et al.Failure of glatiramer acetate to modify the peripheral T cell repertoire of relapsingremitting multiple sclerosis patients［J］.Clin Immunol，2010，135（1）：33-42.

［21］Dubinsky AN，Burt RK，Martin R，et al.T-cell clones persisting in the circulation after autologous hematopoietic SCT are undetectable in the peripheral CD34＋selected graft［J］.Bone Marrow Transplant，2010，45（2）：325-331.

［22］Storek J，Zhao Z，Liu Y，et al.Early recovery of CD4Tcell receptor diversity after“lymphoablative”conditioning and autologous CD34cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2008，14（12）：1373-1379.