Folin-Ciocalteu比色法测定怀山药零余子多酚含量的研究

程云环，滕井通，薛建平，张爱民,盛 玮

（1.淮北师范大学 化学与材料科学学院；2.淮北师范大学 生命科学学院，安徽 淮北 235000）

山药零余子为薯蓣科多年生藤本植物薯蓣(Dioscorea opposita Thunb.)叶腋间的珠芽[1]，俗称“山药蛋”，呈卵圆形或椭圆形，直径在0.4-2.0cm之间，外表呈淡黄色，顶端中间略有茎痕，质坚硬，断面灰白色至灰褐色，气味淡而不苦，口嚼黏腻.主要含有淀粉、多糖、蛋白质、多种游离氨基酸，胆碱、尿囊素、植酸、多种维生素、淀粉酶、山药素等物质[2].自古就是营养价值很高的滋补食品和药用价值很好的药材，但因其体积小、商品价值不高，每年除少量作种用外，大部分都被白白扔掉[3].

多酚是一类广泛存在于植物体内的多羟基酚类化合物的总称，具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、防晒美白、护肝益肾、抗动脉硬化、防治冠心病与中风等心脑血管疾病以及抑菌消炎抗病毒等多种生理功能[4].论文以怀山药及其零余子为供试材料，提取多酚物质并进行含量测定、比较分析，为怀山药零余子进一步开发利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料及处理

怀山药(Dioscorea opposita Thunb.)及其零余子采集于河南省温县，经淮北师范大学生命科学学院薛建平教授鉴定为薯蓣科薯蓣属怀山药及其零余子.将怀山药及其零余子用流动水冲洗，除去附着在表面的泥沙，然后将怀山药（切成片状）和零余子放入电热鼓风干燥箱中60℃烘干至恒重，将烘干后的怀山药和零余子粉碎放入干燥器中备用.

1.2 主要仪器

SHH·W21·420三用电热恒温水浴锅 北京东南仪诚实验室设备有限公司生产；CP213电子分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司生产；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂生产；FDV超微粉碎机 北京环亚天元机械技术有限公司生产；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司生产；755B紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司生产.

1.3 主要试剂

没食子酸标准品 生工生物工程（上海）有限公司产品；1N Folin-Ciocalteu试剂（FC试剂） 上海荔达生物科技有限公司产品；无水碳酸钠、无水乙醇等均为国产分析纯.

1.4 没食子酸标准液的制备

精密称取干燥至恒重的没食子酸0.0500g，用超纯水溶解并定容至100mL，摇匀，即得标准储备液.精密量取1.00mL标准储备液于50mL容量瓶中加超纯水定容至50mL，摇匀，即得浓度为10μg·mL-1的没食子酸标准液，置于冰箱中保存备用.

1.5 怀山药及其零余子样品溶液的制备

精密称取粉碎并干燥至恒重的怀山药及其零余子样品各10.0000g，分别装入圆底烧瓶中，加入体积分数为80%乙醇200mL，摇匀，在70℃水浴中回流提取2h，真空抽滤，洗涤残渣2次，合并洗涤液.将乙醇提取液减压浓缩至无乙醇气味，用蒸馏水将浓缩物溶解并定容至50mL作为储备液，从中量取2.00mL用蒸馏水定容至50mL摇匀、备用.

1.6 Folin-Ciocalteu试剂法比色条件的研究

1.6.1 检测波长的确定

吸取没食子酸标准溶液，显色，用紫外可见分光光度计在400～900nm范围内扫描，选定最大吸收波长为测定波长[5-6].

1.6.2 显色温度的选择

精密吸取1.00mL没食子酸标准液分别置于10mL试管中，加入FC试剂1.0mL，摇匀，静置5min，加入质量分数为10%Na2CO3溶液2.0mL，摇匀.分别置于15，20，25，30，35℃的水浴锅中加热显色150min，在764nm波长处测定吸光值.

1.6.3 显色时间的选择

精密吸取1.00mL没食子酸标准液分别置于10mL试管中，加入FC试剂1.0mL，摇匀，静置5min，加入质量分数为10%Na2CO3溶液2.0mL，摇匀.将试管放置于25℃的恒温水浴锅中加热显色，反应时间分别为60，90，120，150，180min，显色后于764nm波长处测定吸光值.

1.6.4 Folin-Ciocalteu试剂用量的选择

精密吸取1.00mL没食子酸标准液分别置于20mL试管中，加入FC试剂1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，摇匀，静置5min，分别加入同体积的质量分数为10%Na2CO3溶液，置于25℃的恒温水浴锅中加热显色150min，于764nm波长处测定吸光值.

1.6.5 Folin-Ciocalteu试剂与10%Na2CO3比例的选择

精密吸取1.00mL没食子酸标准液分别置于10mL试管中，加入FC试剂1.0mL，摇匀，静置5min，加入不同体积质量分数为10%Na2CO3溶液，使FC试剂与10%Na2CO3溶液体积比分别为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，置于25℃水浴锅中加热显色150min，于764nm波长处测定吸光值.

1.7 标准曲线的绘制

分别精密吸取0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00mL标准储备液于25mL容量瓶中加入蒸馏水定容、摇匀.从上述不同浓度的溶液中，移取5.00mL到100mL容量瓶中，分别加入50mL蒸馏水，加入FC试剂2.0mL摇匀，静置5min，加入质量分数为10%的Na2CO3溶液2.0mL，用蒸馏水定容，置于25℃的恒温水浴锅中加热显色150min，以试剂空白作参比，于最大波长处测定吸光值，以没食子酸质量浓度W（μg·mL-1）为横坐标，吸光值A为纵坐轴，制作标准曲线[7].

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

2.1.1 检测波长

扫描图谱如图1所示，标准品在400～900nm波长范围内只有一个单峰，且最大吸收波长为764nm，因此确定764nm为检测波长.

图1 标准品紫外扫描图

2.1.2 显色温度的选择

由图2可知，随着温度升高，吸光值逐渐增大，当温度到达25℃时，吸光值达到最大值，随后随着温度的升高而降低，因此选择25℃作为显色温度.

图2 反应温度与吸光值的关系

2.1.3 显色时间的选择

由图3可知，随着反应时间的延长，吸光值逐渐增大，当反应时间达到150min后增加不再明显，曲线变得平坦，因此选择150min作为显色时间.

图3 反应时间与吸光值的关系

2.1.4 Folin-Ciocalteu试剂与10%Na2CO3比例的选择

由图4可知，随着质量分数为10%的Na2CO3溶液加入量的增加，吸光值逐渐增加，当加入FC试剂与质量分数为10%Na2CO3溶液的体积比为1∶1时，吸光值达到最大，因此选择两者体积比1∶1作为显色条件.

图4 FC试剂与10%Na2CO3试剂比例与吸光值的关系

2.1.5 Folin-Ciocalteu试剂用量的选择

由图5可知，相同条件下比色液吸光值随FC试剂用量的增加先增加，后降低，当FC试剂的用量为2.0mL时吸光值达到最大，因此显色时FC试剂的用量选择2.0mL.

图5 FC试剂用量与吸光值的关系

2.1.6 线性关系

由图6可见，没食子酸在浓度为1-6μg·mL-1时，没食子酸质量浓度与其吸光值呈良好的线性关系，在此范围内的线性回归方程为A=0.0966W-0.0054，相关系数R2=0.9987.

2.2 总多酚含量测定方法的考察

2.2.1 精密度实验

图6 没食子酸标准曲线

精密吸取怀山药零余子样品溶液1.00mL置于10mL试管中，平行5份，各加入FC试剂2.0mL，摇匀，静置5min，加入质量分数为10%Na2CO3溶液2.0mL，置于25℃的恒温水浴锅中加热显色150min，以试剂空白为参比，于764nm波长处测定吸光值，分别为0.506，0.511，0.513，0.509，0.508，平均值为0.509，其RSD=0.54%（n=5），显示该方法具有较高的精密度，能满足样品分析的要求.

2.2.2 稳定性实验

精密吸取怀山药零余子样品溶液1.00mL置于10mL试管中，加入FC试剂2.0mL，摇匀，静置5min，加入质量分数为10%Na2CO3溶液2.0mL，置于25℃的恒温水浴锅中加热显色150min，显色完全后，分别放置0，10，20，30，40min测定吸光值，分别为0.514，0.513，0.510，0.508，0.504，平均值为0.510，RSD=0.79%（n=5），表明实验稳定性良好.

2.2.3 加标回收实验

精密吸取0.10mL已知怀山药零余子多酚质量浓度为1.00mg·mL-1的样品溶液5份，分别精密加入含有40.00，80.00，120.00，160.00，200.00μg没食子酸对照品溶液，各加入FC试剂2.0mL，摇匀，静置5min，加入.02mL质量分数为10%Na2CO3溶液，置于25℃的恒温水浴锅中加热显色150min，以试剂空白为参比，于764nm波长处测定吸光值，测定结果并计算回收率及RSD，结果见表1.

表1 加标回收实验结果

2.3 样品多酚含量的测定

分别精密吸取怀山药及其零余子样品溶液1.00mL加入试管中，各加入FC试剂2.00mL，摇匀，静置5min，加入2.0mL质量分数为10%的Na2CO3溶液，置于25℃的恒温水浴锅中加热显色150min，以试剂空白为参比，于764nm波长处测其吸光值，平行测定3次，得怀山药零余子样品吸光值分别为0.509，0.510，0.509，平均值为0.509，根据标准曲线回归方程计算出怀山药零余子总多酚含量为0.0666%；怀山药样品吸光值分别为0.340，0.336，0.339，平均值为0.338，根据标准曲线回归方程计算出怀山药总多酚含量为0.0447%.

3 结论与讨论

实验以没食子酸为标准对照品，研究了福林酚试剂法测定多酚的条件，经试验得出测定波长为764nm，确定了福林酚试剂的最佳用量为2.0mL、福林酚试剂与质量分数为10%Na2CO3的最佳比例为1︰1、最佳温度为25℃、反应时间为150min.该测定方法的平均回收率为98.69%，RSD为1.56%，具有较好的精密度.该方法简便、快速、准确，可用于怀山药及其零余子实际样品的测定.

实验通过对怀山药及其零余子的多酚含量的测定，结果表明：怀山药总多酚含量为0.0666%，怀山药零余子中总多酚含量为0.0447%，怀山药零余子中总多酚的含量高于怀山药.

本研究未对怀山药零余子总多酚及鞣质提取工艺进行优化，还需进一步加强研究.

〔1〕赵冰.山药栽培新技术[M].北京：金盾出版社，1998.193.

〔2〕都恒青.常用中药材品种整理和质量研究（北方篇）第二册[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995.1089.

〔3〕薛建平，祝红蕾，尧俊英.铁棍山药及其零余子营养成分的比较研究[J].食品工业科技,2008(8):268-269.

〔4〕冯丽,宋曙辉,赵霖,等.植物多酚种类及其生理功能的研究进展[J].江西农业学报，2007,19(10):105～107.

〔5〕王岸娜,徐山宝,刘小炎,等.福林法测定猕猴桃多酚含量的研究[J].食品科学,2008（29）:398～401.

〔6〕韩菊,魏福祥.Folin-Ciocalteu 比色法测定苹果渣中的多酚[J].食品科学,2010（31）:179～182.

〔7〕吴亮亮,石雪萍,张卫明.Folin-Ciocalteu 比色法测定花椒中多酚含量的研究[J].中国野生植物资源,2010（12）:54～56.