APP下载

东垣益气膏预防性给药对肺气虚证大鼠基质金属蛋白酶表达的影响

2013-01-11赵静李庭凯胡兰贵魏锦萍

中国医药科学 2012年21期
关键词:基质金属蛋白酶

赵静 李庭凯 胡兰贵 魏锦萍

[摘要] 目的 观察东垣益气膏对MMP-2和MMP-9在肺气虚证大鼠模型支气管和肺组织中的表达的影响。 方法 将50只SD大鼠随机分为对照组、模型组、玉屏风组、东垣益气膏低/高剂量组共5组,每组10只。采用烟熏造模法建立肺气虚证大鼠模型,造模同时开始灌胃东垣益气膏,连续60 d。采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物方法检测支气管肺组织中MMP-2和MMP-9的表达。 结果 与对照组比较,模型组MMP-9、MMP-2在支气管肺组织中高表达,差异有统计学意义(P<0.01);给药后与模型组比较,高剂量组和玉屏风组MMP-9、MMP-2表达显著减少,其中高剂量组优于玉屏风组,差异均有统计学意义(P<0.01)。 结论 东垣益气膏可抑制支气管肺组织中MMP-9、MMP-2的表达,在一定程度上阻止肺气虚证模型的形成。

[关键词]东垣益气膏;肺气虚证;基质金属蛋白酶

[中图分类号] R287???[文献标识码] A???[文章编号] 2095-0616(2012)21-28-04

Dongyuan Yiqi ointment in lung-qi card rats matrix metalloproteinases express influence

ZHAO?Jing1??LI?Tingkai1??HU?Langui1??WEI?Jinping2

1.Shanxi Institute of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030012, China;2.China Institute for Radiation Protection, Taiyuan 030006, China

[Abstract] Objective To observe the Dongyuan Yiqi ointment on matrix metalloproteinase 2 and MMP-9 in the lung-qi deficiency syndrome in a rat model of bronchial and pulmonary tissue expression influence. Methods 50 SD rats were randomly divided into control group, model group, Yupingfeng group, Dongyuan Yiqi ointment low and high dose group. A total of five groups,10 rats in each group. The smoked molding method establishment of pulmonary Qi deficiency syndrome in a rat model, modeling at the same time intragastric administration of Dongyuan Yiqi ointment and paste, for 60 days,using immunohistochemical staining method for detection of SABC in pulmonary tissue of MMP-2 and MMP-9 expression. Results Compared with the control group, model group, MMP-9, MMP-2 in bronchopulmonary tissue is highly expressed in (P<0.01), high dose group, and Yupingfeng group MMP-9, MMP-2 expression decreased significantly (P<0.01), wherein the high dose group is better than that of Yupingfeng group (P<0.01). Conclusion The MMP-9, MMP-2 expression in pulmonary tissue can be inhibited by Dongyuan Yiqi ointment, to a certain extent, prevent formation of lung-qi deficiency syndrome model.

[Key words] Dongyuan Yiqi ointment; Lung-qi deficiency syndrome; Matrix metalloproteinase

肺气虚证是肺的卫气、主气功能减退为主的全身性疾病,常反复发作。肺气虚证在人群中的发病率很高,主要罹患人群为中老年患者和儿童,需要从根本上改善患者体质,以预防为主,防治结合,降低肺气虚证的罹患率和复发率。东垣益气膏是来自李东垣的清暑益气汤加减,经过加工熬制的中医传统剂型,是用于防治气虚型外感的常用方剂。本实验采用免疫组织化学染色链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)方法观察东垣益气膏预防性给药对基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在肺气虚证大鼠模型支气管和肺组织中的表达的影响。

1?资料与方法

1.1?实验动物来源

SD大鼠50只,雌雄各半,平均体质量为(200±25)g。在山西省中医药研究院中心实验室动物室清洁级环境下饲养,动物合格证号SCXK(晋)2012-2。

1.2?药物与试剂

东垣益气膏是由山西省中医院和平分院制成的浸膏,主要成分为:生黄芪15 g、炙甘草6 g、党参10 g、当归10 g、麦冬10 g、五味子10 g、青皮10 g、陈皮10 g、神曲10 g等。玉屏风颗粒(广东环球制药有限公司,批号99160)。多聚赖氨酸、一抗、光谱纯试剂(SP)、二氨基联苯胺(Dab),均购于河北博海生物工程开发有限公司。

1.3?主要仪器设备

显微镜(日本奥林巴斯,BX51T-PHD-J11),多功能真彩色细胞图象分析管理系统(美国Media Cybernetics 公司,Image-Pro Plus),切片机(德国莱卡,RM2015),离心机(北京离心机厂,LDZ5-2型)。

1.4?实验方法

1.4.1?模型制作?大鼠适应性喂养l周后,除对照组外,模型组采用文献[1] 的方法,将大鼠分批置入特制的1 m3的烟室中, 用锯末50 g加10支红山茶牌香烟混合点燃烟熏,熏烟 30 min/次, 2次/d;自由进食、饮水,适当通风,以防大鼠窒息。每天观察并记录其症状体征变化,60 d完成造模。

1.4.2?分组与给药?将大鼠随机分为5组,每组10只,雌雄各半。(1)对照组:置于正常无烟环境中饲养,不予处理。(2)模型组:造模开始时以20 mL/(kg·d)灌服无菌水1次/d。(3)阳性对照组:造模开始时予玉屏风颗粒水溶剂5 g/(kg·d)。(4)东垣益气膏低剂量组:造模开始时予东垣益气膏水溶剂灌胃 5 g/(kg·d),相当于成人常规临床用量7倍。(5)东垣益气膏高剂量组:造模开始时予东垣益气膏水溶剂灌胃 10 g/(kg·d),相当于成人常规临床用量的14倍。

1.5?取材及观察指标

1.5.1?症状与体征?观察各组大鼠的活动度、对外界反应的灵敏度、摄食、体重、毛发色泽的变化。

1.5.2?MMP-2和MMP-9表达的检测?取每只大鼠的右肺下叶及气管,按照免疫组织化学染色SABC方法,用磷酸盐缓冲液冲洗、4%多聚甲醛进行脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋,将厚度5 μm的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上,60℃过夜,脱蜡、入水。用正常山羊血清替代一抗作阴性对照。MMP-2和MMP-9的阳性表达以光学显微镜下见细胞质中出现明确的棕黄色颗粒的细胞为标准。结果采用多功能真彩色细胞图象分析管理系(美国Media Cybernetics公司)对MMP-2和 MMP-9的表达进行图像分析,表达结果用阳性面积和平均光密度表示。

1.6?统计学处理

采用 SPSS11.0软件进行统计分析,数据用()表示, 各组间比较用t 检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2?结果

2.1?症状与体征

对照组活泼好动,体形肥胖,毛发光泽,呼吸平稳。模型组大鼠先后出现精神萎靡, 行动迟缓; 体重增幅减小,食量减少;毛发色黄、无光泽易脱落;呼吸加深急促,咳嗽频作,偶有呼吸道分泌物流出。给药组表现介于空白组、模型组之间。

2.2?MMP-2在支气管、肺组织中的表达

对照组大鼠支气管和肺组织中MMP-2少量阳性表达(图1),模型组支气管和肺组织MMP-2阳性表达明显多于对照组(图2),玉屏风组、东垣益气膏高剂量组支气管和肺组织MMP-2阳性表达减少(图3~5)。阴性对照组大鼠支气管、肺组织中MMP-2不表达。其中东垣益气膏高剂量组优于玉屏风组。各组大鼠支气管、肺组织中MMP-2的平均光密度和阳性面积见表1。

2.3?MMP-9在支气管、肺组织中的表达

对照组大鼠支气管和肺组织中MMP-9少量阳性表达(图6),模型组支气管和肺组织MMP-9达明显多于对照组(图7),玉屏风组、东垣益气膏高剂量组支气管和肺组织MMP-9表达减少(图8~10)。阴性对照组大鼠支气管、肺组织中MMP-9表达。其中东垣益气膏高剂量组优于玉屏风组。各组大鼠支气管、肺组织中MMP-9 的平均光密度和阳性面积见表1。

3?讨论

基质金属蛋白酶家族是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶,能降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM),以酶原形式分泌,主要参与组织重建、修复等[2]。ECM 包括纤维性成分、连接蛋白和间质成分,主要为糖胺聚糖等,对细胞增殖和分化发挥重要调控作用。合成这些蛋白质的 ECM 代谢酶可分为基质金属蛋白酶类(MMPs)和基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)[3]。MMP-2和MMP-9作为基质金属蛋白酶中两类具有基质分解活性的酶类,主要水解变性胶原及基膜的主要成分IV型胶原。在正常情况下,构成肺泡壁的ECM的降解与合成处于动态平衡,以保持正常的肺组织结构和肺功能,蛋白酶分泌增加和/或抗蛋白酶减少均可致ECM 受损[4]。正常肺组织中基质金属蛋白酶主要参与肺基质的更新、损伤愈合等,从而使肺基质能够维持气道和肺泡结构的完整,以维持正常的肺功能。本实验造模采用烟熏法,在烟雾的不断刺激下,呼吸道单核巨噬细胞系统被激活,使气道中肺泡巨噬细胞(AM)、嗜中性粒细胞(PMN)等炎性细胞增加,导致MMP-2和MMP-9 在AM 等炎性细胞和部分肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、成纤维细胞中大量合成与分泌[5]。MMP-2和MMP-9大量产生产生和释放后,对肺泡壁的ECM 进行破坏,同时炎症细胞在气道壁、气道腔和肺泡腔中聚集,形成恶性循环,进一步加重了局部的炎症反应,促进了肺气虚证的发生发展。

肺气虚证为肺系病的常见证候,目前对于肺气虚证的治疗研究,多是患病后的治疗,因本证属虚证,易于反复发作,所以单纯的治疗,往往预后不理想,而且日久易变生其他疾病,因此必须重视早期积极干预和治疗,未病先防。本研究中所用的清暑益气汤是山西省中医药研究院已故名老中医朱进忠用于防治气虚型外感的常用方剂,疗效甚佳。本方源于李东垣《脾胃论》,由人参、黄芪、当归、白术、甘草、升麻、葛根、泽泻、神曲、苍术、麦冬、五味子等药物组成。方取党参、黄芪、白术、麦冬、五味子、甘草益气生津,以扶元气;黄柏、苍术、神曲清热燥湿、消食导滞,以祛病邪;升麻、葛根、泽泻以升清降浊;当归、青陈皮以调畅气血;生姜、大枣以调和管卫。聚益气升阳、清热生津、敛阴止汗、健脾燥湿、理气和胃之功效于一体[6]。膏方作为祖国传统医学的重要组成部分之一, 最大的优势是根据中医的基本理论,运用“治未病”的理念,通过“固本、治本”全面防范疾病发生,提高生存质量[7]。用于临床兼顾面广,口感好,不伤脾胃,适宜久服,简单方便,是临床的一种个性化的防治疾病的手段[8],将本方制备成膏用于肺气虚证的防治能很好地体现 “治未病”的思想。本实验结果表明模型组MMP-2和MMP-9表达较对照组明显增强,提示肺气虚证与MMP-2和MMP-9 的表达增加有关。玉屏风组、东垣益气膏高剂量组MMP-2 和MMP-9表达较模型组明显减少,其中高剂量组优于玉屏风组。提示东垣益气膏预防性给药能明显抑制肺气虚证大鼠MMP-2和MMP-9的表达,干预气道重构,在一定程度上阻止肺气虚证模型的形成。这可能是东垣益气膏能有效地干扰“肺气虚证”模型形成的机制之一。

[参考文献]

[1] 王元勋,张敏华,蔡圣荣,等.肺气虚证动物模型的制备[J].中国病理生理杂志,1994,10(1):15.

[2] 张小梅,吴建军,姜良铎,等.安肺益肾方对慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺气道重建的影响[J].环球中医药,2009,2,(3):179-181.

[3] 赵敏,陈忻怕,陈振发.清肺化痰通络方对肺纤维化大鼠基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9表达的影响[J].中国医药导报,2012,9(15):14-16.

[4] 罗慰慈.现代呼吸病学[M].北京:人民军医出版社,1997:119.

[5] 刘向国,方志斌,蔡圣荣,等.肺气虚证模型大鼠肺组织中基质金属蛋白酶表达的变化[J].中国中医药科技,2006,13(5):289-291.

[6] 柯联才.东垣清暑益气汤探微[J].中国中医药报,2005,8(6):1-2.

[7] 胡兰贵.中医治未病与中药膏方[J].中医肠疗特色疗法研讨会论文集,2011:44-47.

[8] 王珺,张婉,陈浩林,等.探讨传统膏方在 “治未病”中的临床体现[J].时珍国医国药,2009,20(12):3100-3101.

(收稿日期:2012-08-09)

猜你喜欢

基质金属蛋白酶
基质金属蛋白酶及其抑制剂在非小细胞肺癌患者中的表达及临床意义
内皮抑素抗肿瘤机制研究进展
冠心病患者血清ICTP水平变化及其临床意义
血清中期因子、血小板因子4和黏蛋白1含量检测对乳腺癌患者病情评估的价值
戊酸雌二醇联合醋酸甲羟孕酮预防人流术后宫腔粘连的效果研究
金雀异黄素对胶原诱导关节炎大鼠发病的预防作用
膝骨性关节炎患者关节液中MMP—7、MMP—9、TIMP—1、TNF—α的表达及意义
脑膜瘤患者围手术期脑脊液中MMP—2、MMP—9、HGF水平的动态变化及其临床意义
瑞舒伐他汀强化降脂对缺血性脑卒中血清基质金属蛋白酶的影响及疗效观察
玻璃酸钠对膝骨性关节炎患者关节液中基质金属蛋白酶—3、9水平的影响及疗效观察