母系遗传非综合征型聋相关线粒体DNA C1494T突变的全国性调查△

李琦 袁永一 黄德亮 韩东一 戴朴

随着分子遗传学技术在神经性聋(sensorineural hearing loss，SNHL)病因学和诊断中的广泛应用，发现线粒体DNA(mtDNA)突变与非综合征型聋(nonsyndromic hearing loss，NSHL)的发病有密切的关系。1993年，第一个导致耳聋的mtDNA A1555G突变被发现[1]。mtDNA A1555G突变是最常见的耳聋相关线粒体基因突变，发生率约为1%～3%[2～4]，其他相关突变如A827G、T961C、T961delT+C(n)ins、T1095C、T7510C、T7511C、G7444A、A7445G等发生率低、难以见到典型的母系遗传家系，耳聋人群中和正常人群中的检出率相差不大。mtDNA C1494T突变作为与药物性聋关系密切的突变，2004年由Zhao等[5]首先报道， 随后又有散发的病例报道[6～10]，但仍未见到在NSHL患者中进行大规模调查的报告。本研究应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，real-time qPCR)在全国范围内对NSHL患者进行mtDNA C1494T的筛查，以期为进一步研究该突变和聋病的基因诊断提供帮助。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集来自北京市、河北涿州市和高碑店市、黑龙江牡丹江市、吉林省吉林市、内蒙古赤峰市、山西大同市和运城市、河南安阳市、湖北武汉市、陕西西安市、甘肃兰州市、宁夏银川市、青海西宁市、安徽省阜阳市、江苏南通市、上海市、福建福州市、广东佛山市、广西柳州市、新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市和库尔勒市、云南昆明市和临沧市、贵州贵阳市、四川成都市、西藏拉萨市、辽宁沈阳市、山东滨州市等25个省市的特教学校和聋哑学校的3 133例感音神经性聋病例为研究对象，排除综合征型聋患者、外耳、中耳畸形者、传导性聋者、智力障碍者。3 133例NSHL患者年龄4～20岁，平均13.82±5.03岁。经病史调查、全身及耳鼻咽喉常规检查、纯音测听明确3 133例均为双侧重度或极重度非综合征型聋。同胞兄弟姐妹者只选取年龄小者1人纳入本项研究，因为C14P4T突变为母系遗传，同胞兄弟姐妹携带相同突变，增加了突变携带频率。

1.2调查方法 采用问卷调查形式，初筛调查先期发放自制式耳聋调查表,由学生家长填写有关信息，同时填写知情同意书，对回答不明确者通过电话问询家长完善相关信息。调查表内容包括聋儿基本信息、耳聋史、家族史、聋儿出生史、个人史(聋前传染病、耳毒性药物应用情况、头部是否受外伤等)、体检(全身及专科查体)等。问卷调查及对参选对象的遴选(按照有关标准纳入、排除)等工作均由经过培训的专业人员完成。所有耳聋患者均抽取静脉血3～5 ml，用以提取基因组DNA。

1.3real-time qPCR扩增 引物和探针在mtDNA 上的位置是11 933～11 952、12 047～12 076和12 012～12 037。正向引物 5′- GCCCTGAAGCGCGTACAC -3′ ，反向引物 5′- TAGAGGAGACAAGTCGTAACATGGTAA-3′，TaqMan MGB探针为5′- FAM-CGTCACCCTCCTCAAG -MGB 3′。PCR反应体系为10 μl体系，包含2×Hotstart Taq PCR Mastermix5 μl(包括dNTPs、Buffer、MgCl2和Taq DNA polymerase,北京天为时代公司)，50 ng/L的模板DNA0.5 μl， 2 μmol/L的正向引物、反向引物各1 μl和2 μmol/L的针对1494C位点的探针0.5 μl(上海基康生物技术公司)，ddH2O加至10 μl。将上述试剂加入0.2 ml薄壁管中，轻弹混匀，短暂离心后进行扩增。PCR扩增反应条件：95 ℃变性10 min，随后95 ℃变性30 s，58 ℃退火60 s，共进行40个循环，在每个循环退火时采集荧光。PCR反应在Corbert Research 公司的Rotor-GenePCR扩增仪上进行。每组PCR反应均设有阳性对照、正常对照及只加水、不加DNA 模板的空白对照。

1.4样本测序 测序用引物序列为：F 5'CGCCATCTTCAGCAAACCCT 3'，R 5'TGCGCCAGGTTTCAATTTCTATC 3'，扩增片段468 bp。引物由北京奥科生物技术公司合成，PCR反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性0.30 min，55 ℃复性0.30 min，72 ℃延伸0.30 min，30个循环，反应终止后再72 ℃延伸5 min。对所有阳性标本进行Big-Dye测序，测序在美国ABI 3100 - Avant Genetic Analyzer测序仪上测序。测序的样本包括所有的real-time qPCR检测阳性样本，以及3 119例阴性样本中随机选择的495例。

1.5结果判定 根据Roter-gene 6软件对所记录的荧光释放量进行分析，如果曲线为不同颜色规整的S形曲线则判为阴性，说明所设计的荧光探针能与扩增产物完全结合，而C1494T突变时该探针不能与扩增产物结合，故没有 S形荧光曲线出现，由此判断发生突变(图1)。

2 结果

3 133例检测样本中发现C1494T突变14例，其中，河南安阳4例、新疆2例、青海西宁1例、云南昆明2例、安徽阜阳2例、四川成都2例、福建福州1例，经测序验证全部为C1494T突变(图2)，总的突变携带率为0.45%(14/3 133)。14例中4例有明确氨基糖苷类抗生素使用史，8例为语前聋，2例语后聋，4例性质不明。495例real-time qPCR检测阴性样本经测序证实均无C1494T突变。

3 讨论

Real-time qPCR是指在PCR反应体系中加入能特异标记PCR产物的荧光物质，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，得到S形的扩增曲线。在突变的诊断方面，对于基因突变设计跨突变位点片段的荧光探针，然后对其进行扩增，直接观察荧光的有无，免去了常规PCR后的电泳检查过程，其敏感性大大超过常规PCR。本研究使用的Taq-Man MGB探针3′端标记的荧光淬灭基团是一种基本无荧光本底的小沟结合物(minor groove binder，MGB)，取代了常规可发光的TAMRA荧光标记，使得荧光本底大大降低，从而提高了分辨率；探针3′端结合的MGB使得探针的Tm值有近10 ℃的提高，提高了配对序列与非配对序列的差异，从而使探针的杂交稳定性和特异性显著增强[11]。另外探针长度缩短，淬灭基团与报告基团在空间位置上更加接近，实验结果更精确。应用TaqMan探针进行基因突变的检测一般基于2条探针，1条探针为突变型探针，另1条为野生型探针，均横跨突变位点，2条探针用2种不同的发光基团标记。本研究仅使用野生型探针，扩增结束时根据熔解曲线判断是否有基因突变，若有基因突变，则无荧光产生，结果发现针对mtDNA C1494T突变设计跨越突变位点的野生型荧光探针检测结果准确，而且降低了设计成本。

图1 real-time qPCR检测mtDNA C1494T突变

图2 测序验证结果阴影部分为突变碱基，箭头所指为突变峰

2004年首先在一个中国大家系中报道了mtDNA C1494T突变，mtDNA 1494位点的胞嘧啶C位于12SrRNA基因的A位点，有明确的生物化学和功能结构方面的证据证明C1494T突变和氨基糖苷类(AmAn)药物诱发的耳聋密切相关，并且与母系遗传性聋家系有关[5]。Zhao等[12]通过细胞融合技术研究了巴龙霉素对携带mtDNA C1494T突变细胞系生长的影响，认为C1494T突变可以造成细胞对氨基糖苷类抗生素的超敏性，mtDNA C1494T突变和氨基糖苷类药物中毒性聋和NSHL有直接的关系。人线粒体12SrRNA的结构和序列与细菌的16SrRNA 类似，12SrRNA是参与构成30S小亚基的分子。mtDNA1494位点位于mtDNA 12SrRNA 倒数第2个螺旋柄的基部,此部位在进化上是高度保守的，mtDNA C1494T突变使第2个柄基部出现一个新的碱基U,这就使它能和与之相对的1555位点上的A配对,根据分子动力学分析，配对的核苷酸比不配对时占有的空间小,同时突变引入一对氢键,使12SrRNA与AmAn结合部位的空间增大，空间体积的变化能促进AmAn与12SrRNA结合区域的结合。这种变化阻碍了线粒体核糖体蛋白质的合成,使氧化磷酸化过程受阻而影响ATP的合成,使Na+、K+、Ca2+离子泵失能，进而导致听毛细胞逐渐死亡,结果引起永久性聋[1,13]。

mtDNA C1494T突变引起的耳聋表型特征为双侧对称性、以高频听力下降为主的感音神经性聋，可以表现为正常听力到极重度感音神经性聋[5,6]。C1494T突变类似于A1555G突变，Zhao等[5]发现C1494T突变致聋一般表现为语后聋或者药物诱发的耳聋。本研究发现mtDNA C1494T突变致聋主要表现为语前聋，因此，mtDNA C1494T突变致耳聋可以有不完全的听力损失外显率，在AmAn等环境因素以及在其他遗传因素如核修饰基因参与下而发生耳聋[5,7]。

本研究结果显示，mtDNA C1494T突变在中国耳聋人群中的发生率为0.45%，其发生率并不高。Li等[2]在温州特教学校的128名耳聋学生中也没有发现C1494T突变，与本研究结果一致，证明了该突变在中国耳聋人群中较为罕见。由于携带率很低，对于河南安阳相对较高的发生率，没有证据支持是由于地区或者民族间的不同导致的，考虑C1494T突变是一偶然现象，单倍型分析应该来自不同的单倍型。Wang等[14]从种系发生的角度研究C1494T突变，认为该突变是一个相当罕见的现象，它的单体型A背景不太可能对C1494T突变的外显率起作用。因此认为，可以不考虑将C1494T列为聋病基因的一线常规检测位点。

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