上海市2011年电子图谱细胞形态现场调查情况分析

宋 颖，王 青，许 蕾，胡晓波

(1.上海市临床检验中心，上海200126;2.上海市第三人民医院检验科，上海201999)

近年来，医疗机构临床实验室中全自动血液分析仪日益普及，随之而来的复检问题则越发显得突出，特别是对于仪器提示报警信号需要人工复片的检测样本，由于需要有经验、训练有素的检验技师用肉眼显微镜观察的方式完成细胞形态学分析，处理速度较慢。血涂片镜检的劳动强度制约了分类计数结果的可靠性。

为了解决这个矛盾，近年来开发出一种全自动的显微镜分析系统Cellavision。这种系统将显微镜与计算机智能模块相整合，能够自动对外周血涂片进行分析，对白细胞和红细胞进行预分类［1］。并且能对血涂片进行数字化处理，得到单个白细胞形态图片、红细胞形态图片和全片血涂片扫描图。与此同时，英国的UK NEQAS已经率先在2005年开发出一种网络化的数字形态学计划，使其用于室间调查计划和继续教育计划。通过网络进行数字化的阅片，分析图片上细胞的形态学信息，并且回报分析结果，再将结果及时反馈参加成员［2］。

为了验证这一系统的准确性和有效性，上海市临床检验中心血液体液室(以下简称“我室”)采用了Cellavision分析系统中的外周血涂片数字化模块，建立了细胞库。于2011年10月至11月间对93家上海市二级甲等以上医院和少量社区卫生服务中心进行了一次电子图谱显微镜细胞形态现场调查，调查的内容包括两个方面:外周血白细胞分类计数和血涂片形态描述，并且对此次调查的方式和数字化图片的质量进行满意度评估。

材料和方法

一.材料

1.在上海市临床检验中心自建的细胞库中选取15张外周血涂片，这些涂片由世界卫生组织(WHO)提供。

2.病例的选择与细胞库 自建的细胞图片库尚在起步阶段，录入的病例数约为100例左右。所收录的病例有严格的标准，应满足以下条件:(1)信息完整;(2)诊断明确;(3)涂片制片、染色质量高;(4)拍摄图片清晰。基于以上要求，目前所收录的病例大多来源于WHO。WHO提供高质量的血涂片，我们将此涂片在Cellavision全自动图片扫描仪上扫描，获取清晰的单个细胞图片。WHO同时也提供了此涂片明确的实验室诊断结果和临床诊断，包括:(1)血液分析仪全血细胞计数和分类计数结果，患者基本信息，入院就诊情况。简要的病史资料，常规生化检查，特定项目生化检查，血红蛋白电泳，MICM(外周血涂片分类及参考范围，骨髓形态分析，CD分型检测，染色体检查)等一系列与诊断密切相关的实验室检查结果;(2)权威专家分析结果，包括病例诊断说明及形态学鉴别诊断;(3)WHO采用May-Grunwald Giemsa染色。细胞图片和染色清晰;(4)采用先进的Cellavision图片扫描技术，得到单个细胞的清晰图像。图片的类型与病例数，见表1。

表1 WHO血涂片所属类型

3.采用双盲法编组，对医院的形态学识别能力做现场调查并统计。

二.方法

1.图片的选择 这次调查对病种的选择上加以限制:选择白细胞分类相对正常，分类难度较低的疾病类型。为了避免调查医院间的重复，选择15例病例，分配至93家医院，每家医院观察一例病例，即本次调查分为15组。每例病例所对应的医院数约为5～7家，而且在涂片观察的难易程度上基本保持一致。

2.外周血涂片扫描 将外周血涂片放在Cellavision分析系统进行规范化处理，处理后的数据录入细胞库中，每个选取病例的白细胞数为(300～400)个。

3.数字化图片 将扫描的白细胞涂片及其他类型的细胞涂片导入大容量存储设备。分配至每家医院的资料中包含患者的基本资料包括:性别，年龄，发病情况和白细胞、红细胞、血小板计数结果和血红蛋白测定结果，观察图片的说明，以及(400～1 000)张数字化的细胞扫描图(白细胞和其他类型细胞)。

4.结果报告方式 按照说明中的所示要求回报结果。先作白细胞分类计数，再将观察到的细胞图片情况进行描述，要求在1 h内完成报告。并在阅片完成后对此次调查的形式和图片质量做出评估。

结 果

一、满意度评价

共发放93份问卷，返回81份。满意度评价结果见表2。

表2 满意度评价表

大部分医院接受此种电子图谱显微镜细胞形态学调查方式，认为清晰度高、细胞形态完整、没有生物学污染;而且在公正性和结果一致性方面也优于血涂片观察。缺点在于，有些医院的检验员习惯采用显微镜肉眼观察的方式，对直接看数字化图片不适应。对于图谱的质量大部分医院也表示满意，但最好能提供低倍，视野更大的图谱，便于总体观察。认为在保证数字化图片质量的前提下，此种方法更方便，清晰，易于计数。

二、病例类型

由于限制白细胞分类的阅片难度，所选择的病例红细胞系统异常占多数，所以阅片的难点在于对红细胞形态的识别和描述。

三、白细胞分类的评价

虽然每张血涂片WHO都给出了明确的诊断和细胞分类计数结果，但我室在参考此结果的同时，也对回报的分类结果用 Rümke法进行统计［3］，得出均值和允许范围。由于白细胞分类计数所得结果为百分比，所以仅以白细胞中的粒细胞计数结果(p)和非粒细胞计数结果(1-p)作为依据计算Rümke范围［3］。且粒细胞计数结果在细胞计数数量较大的情况下可视为符合正态分布［4］，所以可计算组内平均值、标准差(SD)和变异系数(CV%)，见表3。

表3 白细胞分类计数结果的评价

表3结果显示，依据调查结果得出的Rümke范围与WHO范围存在差异，而二者间的平均值、SD和CV%，做配对t检验得到结果分别为P=0.438 8，P=0.150 4，P=0.181 5，差异无统计学意义(P＞0.05)。

四、形态学特点

本次调查除了要求对白细胞进行分类之外，还要求对图谱上所示的异常形态进行描述。形态学特点则参考WHO提供的5个最明显的形态特征，调查所占百分比最高的为红细胞系统疾病，所以形态学特点以红细胞系统形态异常居多(19项)，白细胞系统次之(10项)，血小板最少(5项)，各系统形态学特征的符合率见表4。

表4 各系统形态学特征的符合率

讨 论

一、对于此种全新的电子图谱显微镜调查形式，大多数医院表示满意，并且愿意接受。

二、数字化图片与血涂片显微镜镜检白细胞分类结果比较后，可得出以下几点:

1.观察区域的差异 采用数字化扫描后，观察区域存在限制性。常规显微镜观察则很难做到不同观察者所观察的区域一致。

2.细胞数量的差异 本次调查扫描的白细胞数大致为300～400个，每家医院自行确定所观察的细胞数量。但即使全部观察，也只观察了400个左右的白细胞。而血涂片显微镜观察由于区域的不确定，所以不同观察者所看的细胞总和几乎都＞400个。

3.细胞观察重合度的差异 扫描次序为逐一扫描，所以严格按照生成的图片先后的序列排列，即图片的序列号排列，调查时观察者一般均按照此序列观察，不同观察者所看的图片重合度极高，而常规血涂片显微镜观察往往区域分散，很难做到所看细胞的一致。

4.细胞平均数的一致 实验结果得出的调查平均值与WHO平均值无明显差异，证实了细胞分类结果的可靠性。

鉴于以上几点原因，直接导致本次调查所得到的Rümke范围与WHO给出的范围不一致，所以应对数字化的图片分类结果进行修正。两者间的平均值、SD和CV%无明显性差异，则说明在扫描图片质量得到保证的前提下，可以替代血涂片进行形态学分析。

三、重新回顾细胞图片后发现存在以下几个问题

1.对于特殊细胞形态不认识，如:G6PD酶缺乏时出现的咬细胞(bite cell)、镰刀状红细胞和球形红细胞。

2.对于某些细胞的特征性改变的数量达到多少比例报告没有概念。

3.细胞图片中某一类细胞数量明显增多(如图片中棘形红细胞明显增多占红细胞总数的50%)，其他细胞特征(如:靶形红细胞、红细胞碎片)相对不明显。

4.红细胞呈缗钱状排列，干扰单个红细胞形态识别，无法辨识红细胞大、小不一。

5.对于嗜碱性点彩红细胞等红细胞胞内含有的细小颗粒识别度不够。

6.仅在某几张图片中出现的形态学特征，可能会遗漏(如:血小板成堆现象仅出现在一两张图片中，相对于400张左右的图片，所占比例过低)。

四、改进措施

1.为了提高图片中所含红细胞的形态学信息，应同时提供倍数相对较低，但视野较广的图片。Cellavision的红细胞模块，可以将多个视野所观察到的图片经过计算机处理后，形成一张总图。通过这张图片能很好的识别红细胞系统的异常特征。

2.应建立细胞分级标准，对于图片中某一特征性指标，进行量化处理，可用百分比统计(特征细胞占所有细胞的比例)。特征细胞的数量超出限值，则报告此类细胞增多。有了量化指标，才能避免漏报。

3.不断提高扫描图片的质量，染色佳、扫描后细胞分布均匀的数字化图片更有利于形态学观察。

［1］Kratz A，Bengtsson HI，Casey JE，et al.Performance evaluation of the CellaVision DM96 system:WBC differentials by automated digital image analysis supported by an artificial neural network［J］.Am J Clin Pathol，2005，124:770-781.

［2］Burthem J，Brereton M，Ardern J，et al.The use of digital'virtual slides'in the quality assessment of haematological morphology:results of a pilot exercise involving UK NEQAS(H)participants［J］.Br J Haematol，2005，130(2):293-296.

［3］Clinical and Laboratory Standards Institute.Reference leukocyte(WBC)differential count(proportional)and evaluation of instrumental methods;approved standardsecond edition［S］.H20-A2，CLSI，2007.

［4］ 冯仁丰 .实用医学检验学［M］.上海:上海科学技术出版社，1996:80.