HR-HPV DNA PCR联合TCT检测对宫颈癌前病变的诊断价值

陈炎添，陈青龙，熊 燕，苏雪棠，黄伟刚，石 胜，郭翼华，陈荣策

(江门市人民医院检验科，广东江门529020)

宫颈癌作为妇科生殖道三大恶性肿瘤之一，严重影响女性身心健康及生命安全。我国宫颈癌的发病率及病死率比较高，年发病率超过全世界发病率的30%，每年大约死于宫颈癌的患者约有5万人［1］。有文献报道，早期宫颈癌患者的5年治愈率可高达90%，所以早发现、早诊断、早治疗对于宫颈上皮内瘤变的患者有重大的意义［2］。人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持续感染是癌前病变及宫颈癌发病的重要致病因子［3］，有学者将高危型(higu risk，HR)-HPV DNA检测作为宫颈癌筛查方法之一［4］。本研究拟探讨宫颈液基薄层细胞学检查(thinprep cytology test，TCT)联合 HRHPV DNA聚合酶链反应(PCR)检测在提高宫颈癌前病变的早期诊断中的价值。

材料和方法

一、研究对象

收集2009年10月至2011年9月来江门市人民医院妇产科门诊进行宫颈癌前病变筛查的女性948例，年龄20～65岁，平均年龄41.8岁，所有病例均无子宫颈锥切、急性生殖道炎症及子宫切除等病史。

二、仪器、试剂及试验方法

1.HPV DNA PCR 采用广州中山大学达安基因股份公司生产的核酸扩增仪DA-7600型检测系统进行PCR扩增、杂交、洗膜及显色，使用原装配套试剂HR-HPV(18个型)核酸定量检测试剂盒(PCR荧光法)，可同时检测18种HR-HPV亚型，包括 HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4。用宫颈刷置于宫颈口转动4圈，以取得足量的分泌物及脱落细胞，然后将宫颈刷放入备有1 mL洗脱液的专用洗脱管中送检或保存于-20℃冰箱待测。检测时将宫颈刷在洗脱管中充分漂洗，把洗脱液全部转移到1.5 mL微量离心管中，11 600×g离心10 mim，弃去上清液，保留管底的细胞块。加入50 μL裂解液悬浮沉淀，100℃水浴加热10 min，11 600×g离心10 min，保留上清液待用。HPV基因扩增:取1 μL DNA抽提液，加入HPV PCR扩增体系，按照试剂盒的扩增程序进行扩增反应。导流杂交法进行HPV基因的分型:将20 μL生物素标记的PCR产物经过变性，与1 mL预热至45℃的杂交缓冲液混合，在导流杂交仪HybriMax上45℃孵育5 min后进行导流杂交。杂交后再用0.8 mL杂交缓冲液冲洗3次。在25℃下用封阻液封阻孵育5 min。封阻后加入0.5 mL酶标液孵育3.5 min。用冲洗缓冲液A冲洗杂交膜，去除未结合的酶标液，显色过程中加入0.5 mL四唑硝基蓝(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)底物在36℃保持3～5 min或直到显色完成为止。在显色后1 h内察看分析结果。

2.TCT 擦去宫颈表面黏液，将宫颈细胞刷插入距宫颈管内1 cm处，顺时针旋转5圈左右，取出转入细胞保存液中，对于瓶中收集到的细胞经Prep 2000系统程序化进行薄片涂片染色，TCT制片后，均由专门医师阅片报告。诊断标准采用2001年国际癌症协会TBS诊断系统:(1)正常范围;(2)意义不明的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)和腺细胞(AGUS);(3)不除外高度鳞状上皮病变不典型鳞状细胞(ASC-H);(4)低度鳞状上皮内病变(LSIL);(5)高度鳞状上皮内病变(HSIL);(6)鳞状细胞癌(SCC)和腺癌。

3.病理学检查 对于TCT以及HR-HPV DNA PCR结果呈阳性的病例均通过电子阴道镜下或宫颈锥切下行病理活检，组织病理学CIN分级按Riehart标准判定诊断结果。

三、统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计处理，本研究数据为成对计数数据，采用χ2检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

一、TCT阳性合并HPV阳性者共259例，其中的 AUSCS、LSIL、HSIL、SCC 4 种类型的阳性例数及HPV感染率，见表1。各组间的HPV感染率、HR-HPV感染率、低危型(LR)-HPV感染率互相比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，即随着癌前病变级别的升高，HR-HPV的感染率亦明显升高。说明ASCUS和LSIL患者多为HPV阴性或LR-HPV感染的患者，HSIL和SCC患者多为HR-HPV感染的患者，同时提示SCC与HR-HPV感染密切相关。

二、TCT结果异常者540例，其中活检为异常者144例，符合率为26.7%;TCT正常者408例，其中活检为正常者408例，符合率为100.0%，两者差异具有统计学意义(P＜0.01)。

三、活检确诊 CINⅡ级以上者73例，HRHPV阳性66例，敏感性90.4%，TCT阳性60例，敏感性为82.2%，两者敏感性差异无统计学意义(P＞0.05)。2种方法联合检测敏感性升高，与TCT和HR-HPV单独检测敏感性比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。活检确诊为阴性者804例，HR-HPV检测阴性。HR-HPV、TCT及HR-HPV和TCT联合检测的阳性预测值分别为25.5%、11.1%、28.2%，阴性预测值分别为 68.8%、 59.2%、40.8%，见表2。

表1 ASCUS、LSIL、HSIL、SCC 4种类型的阳性例数及HPV感染率的比较

表2 宫颈癌HR-HPV和TCT的敏感性、特异性 (%)

讨 论

由于从宫颈癌前病变发展为宫颈癌是一个时间漫长的过程，如果能及时早期发现宫颈癌并给予恰当的处理，宫颈癌是可以治愈的。女性在感染HPV后，30% ～50%会出现宫颈上皮内轻度病变，但大部分在感染HPV后转为正常，只有HRHPV持续感染的女性，才成为宫颈癌的高发人群［5］。由HR-HPV感染到发展成为宫颈癌约需9～25年时间，潜伏期长有可能与病毒整合到宿主核基因组适当的位置需要很长时间有关［6］，因此，选择合理、规范的宫颈癌早期筛查的方法对于提高其检出率具有重要意义［7］。目前使用TCT方法能够采集到颈管细胞，制作时剔除了宫颈黏液和炎性细胞，其清晰度和检出率均明显高于常规的宫颈涂片，但同时也发现TCT对HPV诊断有一定的漏诊率［8］。从本研究结果可以看出，联合检测TCT和HR-HPV对宫颈癌的检出率比单独检测TCT或HR-HPV高，联合检测方法对诊断宫颈癌具有重要意义。

本研究中TCT阳性的患者，HR-HPV感染率随着宫颈病变程度的加重呈上升趋势，从而认为HR-HPV感染与宫颈病变的严重程度呈正相关。宫颈癌的筛查中HR-HPV检测是一个非常有意义的指标。本研究还发现，ASCUS与LSIL患者多为HPV阴性或LR-HPV感染的患者，HSIL与SCC患者多为HR-HPV感染的患者，从而说明感染HPV的危险类型与细胞学分级一致，低危型者细胞分化好，高危型者细胞分化差，与文献［9］报道相类似。

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